ප්‍රමාණාත්මක ගිබෙරෙලින් ජෛව සංවේදකය, වෙඩි තැබීමේ අග්‍රස්ථ මෙරිස්ටම් හි අභ්‍යන්තර පිරිවිතරයේ ගිබෙරෙලින් වල කාර්යභාරය හෙළි කරයි.

කඳේ ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පය සඳහා ෂූට් ඇපිකල් මෙරිස්ටම් (SAM) වර්ධනය ඉතා වැදගත් වේ. ශාක හෝමෝනගිබෙරෙලින්(GAs) ශාක වර්ධනය සම්බන්ධීකරණය කිරීමේදී ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි, නමුත් SAM හි ඒවායේ කාර්යභාරය තවමත් දුර්වල ලෙස වටහාගෙන ඇත. මෙහිදී, GA හඳුනාගැනීමේදී එහි පිරිහීම ආරක්ෂා කරමින් GA පිටපත් කිරීමේ ප්‍රතිචාරයේ එහි අත්‍යවශ්‍ය නියාමන ක්‍රියාකාරිත්වය මැඩපැවැත්වීම සඳහා DELLA ප්‍රෝටීනය ඉංජිනේරුකරණය කිරීමෙන් අපි GA සංඥාකරණයේ අනුපාතමිතික ජෛව සංවේදකයක් සංවර්ධනය කළෙමු. මෙම පිරිහීම මත පදනම් වූ ජෛව සංවේදකය සංවර්ධනය අතරතුර GA මට්ටම්වල සහ සෛලීය සංවේදනයේ වෙනස්කම් නිවැරදිව වාර්තා කරන බව අපි පෙන්නුම් කරමු. SAM හි GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරකම් සිතියම්ගත කිරීම සඳහා අපි මෙම ජෛව සංවේදකය භාවිතා කළෙමු. ඉන්ටර්නෝඩ් සෛල සඳහා පූර්වගාමීන් වන ඉන්ද්‍රිය ප්‍රාථමික අතර පිහිටා ඇති සෛලවල ඉහළ GA සංඥා ප්‍රධාන වශයෙන් පවතින බව අපි පෙන්වමු. ලාභ සහ ක්‍රියාකාරීත්වය නැතිවීමේ ප්‍රවේශයන් භාවිතා කරමින්, GA සෛල බෙදීමේ තලයේ දිශානතිය නියාමනය කරන බවත්, ඉන්ටර්නෝඩ් වල කැනොනිකල් සෛලීය සංවිධානය ස්ථාපිත කරන බවත්, එමඟින් SAM හි ඉන්ටර්නෝඩ් පිරිවිතර ප්‍රවර්ධනය කරන බවත් අපි තවදුරටත් පෙන්නුම් කරමු.
අංකුර මුදුනේ පිහිටා ඇති අංකුර අග්‍ර මෙරිස්ටම් (SAM) හි, ශාකයේ ජීවිත කාලය පුරාම මොඩියුලර් සහ පුනරාවර්තන ආකාරයෙන් පාර්ශ්වීය අවයව සහ කඳ නෝඩ් ජනනය කරන ක්‍රියාකාරිත්වයක් ඇති කඳ සෛල නිකේතනයක් අඩංගු වේ. මෙම පුනරාවර්තන ඒකක හෝ ශාක නෝඩ් එක් එක් නෝඩ්, නෝඩ් වල අභ්‍යන්තර නෝඩ් සහ පාර්ශ්වීය අවයව සහ පත්‍ර අක්ෂවල අක්ෂීය මෙරිස්ටම් ඇතුළත් වේ1. සංවර්ධනය අතරතුර ශාක නෝඩ් වල වර්ධනය හා සංවිධානය වෙනස් වේ. අරාබිඩොප්සිස් හි, ශාකමය අවධියේදී අභ්‍යන්තර නෝඩල් වර්ධනය මර්දනය කරනු ලබන අතර, අක්ෂීය මෙරිස්ටම් රොසෙටා කොළ වල අක්ෂවල නිද්‍රාශීලීව පවතී. මල් අවධියට සංක්‍රමණය වීමේදී, SAM පුෂ්ප මංජරිය මෙරිස්ටම් බවට පත් වන අතර, දිගටි අන්තරාල සහ අක්ෂීය අංකුර, කෝලයින් කොළ වල අක්ෂවල අතු සහ පසුව, පත්‍ර රහිත මල් 2 ජනනය කරයි. කොළ, මල් සහ අතු ආරම්භ කිරීම පාලනය කරන යාන්ත්‍රණයන් තේරුම් ගැනීමේදී අප සැලකිය යුතු ප්‍රගතියක් ලබා ඇතත්, අන්තරාල ඇති වන ආකාරය පිළිබඳව සාපේක්ෂව දන්නේ අල්ප වශයෙනි.
GAs වල අවකාශීය කාල ව්‍යාප්තිය අවබෝධ කර ගැනීම විවිධ පටක වල සහ විවිධ සංවර්ධන අවධීන්හිදී මෙම හෝමෝනවල ක්‍රියාකාරිත්වය වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීමට උපකාරී වේ. තමන්ගේම ප්‍රවර්ධකයාගේ ක්‍රියාකාරිත්වය යටතේ ප්‍රකාශිත RGA-GFP විලයනයේ පිරිහීම දෘශ්‍යකරණය කිරීම මුල්වල මුළු GA මට්ටම් නියාමනය කිරීම පිළිබඳ වැදගත් තොරතුරු සපයයි15,16. කෙසේ වෙතත්, RGA ප්‍රකාශනය පටක හරහා වෙනස් වේ17 සහ GA18 මගින් නියාමනය කරනු ලැබේ. මේ අනුව, RGA ප්‍රවර්ධකයේ අවකල ප්‍රකාශනය RGA-GFP සමඟ නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රතිදීප්ත රටාවට හේතු විය හැකි අතර එම නිසා මෙම ක්‍රමය ප්‍රමාණාත්මක නොවේ. වඩාත් මෑතකදී, ජෛව ක්‍රියාකාරී ෆ්ලෝරෝසීන් (Fl)-ලේබල් කරන ලද GA19,20 මූල අන්තරාසර්ග බාහිකයේ GA සමුච්චය වීම සහ GA ප්‍රවාහනය මගින් එහි සෛලීය මට්ටම් නියාමනය කිරීම හෙළි කළේය. මෑතකදී, GA FRET සංවේදකය nlsGPS1 මගින් GA මට්ටම් මුල්, සූතිකා සහ අඳුරු-වැඩුණු හයිපොකොටයිල් වල සෛල දිගු කිරීම සමඟ සහසම්බන්ධ වන බව පෙන්නුම් කළේය21. කෙසේ වෙතත්, අප දැක ඇති පරිදි, GA සාන්ද්‍රණය GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් පාලනය කරන එකම පරාමිතිය නොවේ, මන්ද එය සංකීර්ණ සංවේදක ක්‍රියාවලීන් මත රඳා පවතී. මෙහිදී, DELLA සහ GA සංඥා මාර්ග පිළිබඳ අපගේ අවබෝධය මත පදනම්ව, GA සංඥාකරණය සඳහා පිරිහීම මත පදනම් වූ අනුපාතමිතික ජෛව සංවේදකයක සංවර්ධනය සහ ලක්ෂණ අපි වාර්තා කරමු. මෙම ප්‍රමාණාත්මක ජෛව සංවේදකය සංවර්ධනය කිරීම සඳහා, අපි ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීනයකට ඒකාබද්ධ කර පටකවල සෑම තැනකම ප්‍රකාශ කරන ලද විකෘති GA-සංවේදී RGA එකක් මෙන්ම GA-සංවේදී නොවන ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීනයක් භාවිතා කළෙමු. විකෘති RGA ප්‍රෝටීන් විලයන සෑම තැනකම ප්‍රකාශ වන විට අන්තරාසර්ග GA සංඥාකරණයට බාධා නොකරන බවත්, මෙම ජෛව සංවේදකයට ඉහළ අවකාශීය විභේදනයක් සහිත සංවේදක උපකරණය මගින් GA ආදානය සහ GA සංඥා සැකසීම යන දෙකෙහිම ප්‍රතිඵලයක් ලෙස සංඥා ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රමාණනය කළ හැකි බවත් අපි පෙන්වමු. GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වයේ අවකාශීය කාල ව්‍යාප්තිය සිතියම්ගත කිරීමට සහ SAM එපීඩර්මිස් හි GA සෛලීය හැසිරීම නියාමනය කරන ආකාරය ප්‍රමාණනය කිරීමට අපි මෙම ජෛව සංවේදකය භාවිතා කළෙමු. ඉන්ද්‍රිය ප්‍රාථමික අතර පිහිටා ඇති SAM සෛලවල බෙදීම් තලයේ දිශානතිය GA නියාමනය කරන බව අපි පෙන්නුම් කරන අතර එමඟින් ඉන්ටර්නෝඩයේ කැනොනිකල් සෛලීය සංවිධානය නිර්වචනය කරමු.
අවසාන වශයෙන්, qmRGA හට වර්ධනය වන හයිපොකොටයිල් භාවිතයෙන් අන්තරාසර්ග GA මට්ටම්වල වෙනස්කම් වාර්තා කළ හැකිද යන්න අපි විමසුවෙමු. නයිට්‍රේට් GA සංස්ලේෂණය වැඩි කිරීමෙන් සහ අනෙක් අතට, DELLA34 හායනය මගින් වර්ධනය උත්තේජනය කරන බව අපි කලින් පෙන්වා දුන්නෙමු. ඒ අනුව, බහුල නයිට්‍රේට් සැපයුම (10 mM NO3−) යටතේ වගා කරන ලද pUBQ10::qmRGA බීජ පැලවල හයිපොකොටයිල් දිග නයිට්‍රේට් ඌනතා තත්වයන් යටතේ වගා කරන ලද බීජ පැලවලට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස දිගු බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (පරිපූරක රූපය 6a). වර්ධන ප්‍රතිචාරයට අනුකූලව, නයිට්‍රේට් නොමැති විට වගා කරන ලද බීජ පැලවලට වඩා 10 mM NO3− තත්වයන් යටතේ වගා කරන ලද බීජ පැලවල හයිපොකොටයිල් වල GA සංඥා වැඩි විය (පරිපූරක රූපය 6b, c). මේ අනුව, qmRGA GA සාන්ද්‍රණයේ අන්තරාසර්ග වෙනස්කම් මගින් ප්‍රේරණය වන GA සංඥාකරණයේ වෙනස්කම් නිරීක්ෂණය කිරීමට ද හැකියාව ලබා දෙයි.
qmRGA මගින් අනාවරණය කරගත් GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය සංවේදක සැලසුම මත පදනම්ව අපේක්ෂා කළ පරිදි, GA සාන්ද්‍රණය සහ GA සංජානනය මත රඳා පවතීද යන්න තේරුම් ගැනීමට, අපි ශාකමය සහ ප්‍රජනක පටක වල GID1 ප්‍රතිග්‍රාහක තුනේ ප්‍රකාශනය විශ්ලේෂණය කළෙමු. බීජ පැල වලදී, GID1-GUS වාර්තාකරු රේඛාව පෙන්නුම් කළේ GID1a සහ c කොටිලෙඩෝන වල ඉහළ ප්‍රකාශනයක් ඇති බවයි (රූපය 3a-c). ඊට අමතරව, ප්‍රතිග්‍රාහක තුනම කොළ, පාර්ශ්වීය මූල ප්‍රිමෝර්ඩියා, මූල ඉඟි (GID1b හි මූල තොප්පිය හැර) සහ සනාල පද්ධතිය (රූපය 3a-c) තුළ ප්‍රකාශ විය. SAM පුෂ්ප මංජරියේදී, අපි GID1b සහ 1c සඳහා පමණක් GUS සංඥා අනාවරණය කර ගත්තෙමු (පරිපූරක රූපය 7a-c). ස්ථානීය දෙමුහුන්කරණය මෙම ප්‍රකාශන රටා තහවුරු කළ අතර GID1c SAM හි අඩු මට්ටම්වල ඒකාකාරව ප්‍රකාශ වූ බව තවදුරටත් පෙන්නුම් කළ අතර GID1b SAM හි පරිධියේ ඉහළ ප්‍රකාශනයක් පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක රූපය 7d-l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b පරිවර්තන විලයනය මගින් SAM මධ්‍යයේ අඩු හෝ ප්‍රකාශනයක් නොමැති ප්‍රකාශනයේ සිට ඉන්ද්‍රිය මායිම්වල ඉහළ ප්‍රකාශනය දක්වා GID1b ප්‍රකාශනයේ ශ්‍රේණිගත පරාසයක් ද අනාවරණය විය (පරිපූරක රූපය 7m). මේ අනුව, GID1 ප්‍රතිග්‍රාහක පටක හරහා සහ ඇතුළත ඒකාකාරව බෙදා හරිනු නොලැබේ. පසුකාලීන අත්හදා බැලීම් වලදී, GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) හි අධික ප්‍රකාශනය හයිපොකොටයිල් වල qmRGA හි සංවේදීතාව බාහිර GA යෙදුමට වැඩි කරන බව ද අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 3d, e). ඊට වෙනස්ව, හයිපොකොටයිල් හි qd17mRGA මගින් මනිනු ලබන ප්‍රතිදීප්තතාවය GA3 ප්‍රතිකාරයට සංවේදී නොවීය (රූපය 3f, g). පරීක්ෂණ දෙකටම, GID1 ප්‍රතිග්‍රාහකයට බන්ධනය වීමේ හැකියාව වැඩි දියුණු කරන ලද හෝ නැති වූ සංවේදකයේ වේගවත් හැසිරීම තක්සේරු කිරීම සඳහා බීජ පැල GA (100 μM GA3) හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයකින් ප්‍රතිකාර කරන ලදී. මෙම ප්‍රතිඵල එක්ව, qmRGA ජෛව සංවේදකය GA සහ GA සංවේදකයක් ලෙස ඒකාබද්ධ කාර්යයක් ඉටු කරන බව තහවුරු කරන අතර, GID1 ප්‍රතිග්‍රාහකයේ අවකල ප්‍රකාශනය මඟින් සංවේදකයේ විමෝචනය සැලකිය යුතු ලෙස මොඩියුලේට් කළ හැකි බව යෝජනා කරයි.
අද වන විට, SAM හි GA සංඥා ව්‍යාප්තිය අපැහැදිලිව පවතී. එබැවින්, L1 ස්ථරය (එපීඩර්මිස්; රූපය 4a, b, ක්‍රම සහ අතිරේක ක්‍රම බලන්න) කෙරෙහි අවධානය යොමු කරමින්, GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වයේ අධි-විභේදන ප්‍රමාණාත්මක සිතියම් ගණනය කිරීම සඳහා අපි qmRGA-ප්‍රකාශන ශාක සහ pCLV3::mCherry-NLS කඳ සෛල වාර්තාකරු35 භාවිතා කළෙමු, මන්ද L1 SAM වර්ධනය පාලනය කිරීමේදී ප්‍රධාන කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි36. මෙහිදී, pCLV3::mCherry-NLS ප්‍රකාශනය GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වයේ අවකාශීය කාල ව්‍යාප්තිය විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා ස්ථාවර ජ්‍යාමිතික යොමු ලක්ෂ්‍යයක් ලබා දුන්නේය37. පාර්ශ්වීය අවයව සංවර්ධනය සඳහා GA අත්‍යවශ්‍ය යැයි සලකනු ලැබුවද4, P3 අවධියේ සිට ආරම්භ වන මල් ප්‍රාථමික (P) හි GA සංඥා අඩු බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 4a, b), තරුණ P1 සහ P2 ප්‍රාථමික මධ්‍යම කලාපයේ (රූපය 4a, b) සමාන මධ්‍යස්ථ ක්‍රියාකාරකම් ඇති අතර. ඉන්ද්‍රිය ප්‍රිමෝඩියම් මායිම්වලදී, P1/P2 (මායිමේ පැතිවලින්) සිට P4 හි උච්චතම අවස්ථාවට ළඟා වෙමින් ඉහළ GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වය අනාවරණය විය, මෙන්ම ප්‍රිමෝඩියම් අතර පිහිටා ඇති පර්යන්ත කලාපයේ සියලුම සෛලවල (රූපය 4a, b සහ අතිරේක රූපය 8a, b). මෙම ඉහළ GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වය එපීඩර්මිස් වල පමණක් නොව L2 සහ ඉහළ L3 ස්ථරවල ද නිරීක්ෂණය විය (පරිපූරක රූපය 8b). qmRGA භාවිතයෙන් SAM හි අනාවරණය වූ GA සංඥා රටාව ද කාලයත් සමඟ නොවෙනස්ව පැවතුනි (පරිපූරක රූපය 8c–f, k). අපි විස්තරාත්මකව සංලක්ෂිත කළ ස්වාධීන රේඛා පහකින් T3 ශාකවල SAM හි qd17mRGA ගොඩනැගීම ක්‍රමානුකූලව අඩු කළද, pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP ගොඩනැගීම සමඟ ලබාගත් ප්‍රතිදීප්ත රටා විශ්ලේෂණය කිරීමට අපට හැකි විය (පරිපූරක රූපය 8g–j, l). මෙම පාලන රේඛාවේදී, SAM හි ප්‍රතිදීප්ත අනුපාතයේ සුළු වෙනස්කම් පමණක් අනාවරණය විය, නමුත් SAM මධ්‍යස්ථානයේදී අපි TagBFP හා සම්බන්ධ VENUS හි පැහැදිලි සහ අනපේක්ෂිත අඩුවීමක් නිරීක්ෂණය කළෙමු. qmRGA විසින් නිරීක්ෂණය කරන ලද සංඥා රටාව mRGA-VENUS හි GA-ආශ්‍රිත පරිහානිය පිළිබිඹු කරන බව මෙයින් සනාථ වේ, නමුත් qmRGA මෙරිස්ටම් මධ්‍යස්ථානයේ GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් අධිතක්සේරු කළ හැකි බව ද පෙන්නුම් කරයි. සාරාංශයක් ලෙස, අපගේ ප්‍රතිඵල මගින් ප්‍රිමෝර්ඩියම් ව්‍යාප්තිය ප්‍රධාන වශයෙන් පිළිබිඹු කරන GA සංඥා රටාවක් හෙළි කරයි. අන්තර්-ප්‍රිමෝර්ඩියම් කලාපයේ (IPR) මෙම ව්‍යාප්තිය සිදුවන්නේ වර්ධනය වන ප්‍රිමෝර්ඩියම් සහ මධ්‍යම කලාපය අතර ඉහළ GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් ක්‍රමයෙන් ස්ථාපිත වීම නිසා වන අතර ඒ සමඟම ප්‍රිමෝර්ඩියම් හි GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් අඩු වේ (රූපය 4c, d).
GID1b සහ GID1c ප්‍රතිග්‍රාහකවල ව්‍යාප්තිය (ඉහත බලන්න) යෝජනා කරන්නේ GA ප්‍රතිග්‍රාහකවල අවකල ප්‍රකාශනය SAM හි GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වයේ රටාව හැඩගැස්වීමට උපකාරී වන බවයි. GA හි අවකල සමුච්චය සම්බන්ධ විය හැකිදැයි අපි කල්පනා කළෙමු. මෙම හැකියාව විමර්ශනය කිරීම සඳහා, අපි nlsGPS1 GA FRET සංවේදකය21 භාවිතා කළෙමු. 10 μM GA4+7 සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද nlsGPS1 හි SAM හි මිනිත්තු 100 ක් සඳහා වැඩි සක්‍රිය කිරීමේ සංඛ්‍යාතය අනාවරණය විය (පරිපූරක රූපය 9a-e), එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ nlsGPS1 මූලයන්21 හි මෙන් SAM හි GA සාන්ද්‍රණයේ වෙනස්කම් වලට ප්‍රතිචාර දක්වන බවයි. nlsGPS1 සක්‍රිය කිරීමේ සංඛ්‍යාතයේ අවකාශීය ව්‍යාප්තිය SAM හි පිටත ස්ථරවල සාපේක්ෂව අඩු GA මට්ටම් හෙළි කළ නමුත් ඒවා SAM හි මධ්‍යයේ සහ මායිම්වල ඉහළ ගොස් ඇති බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 4e සහ පරිපූරක රූපය 9a,c). මෙයින් ඇඟවෙන්නේ qmRGA මගින් හෙළි කරන ලද ඒවාට සමාන අවකාශීය රටාවක් සමඟ GA SAM හි ද බෙදා හරින බවයි. අනුපූරක ප්‍රවේශයක් ලෙස, අපි SAM එක ප්‍රතිදීප්ත GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) හෝ Fl පමණක් සෘණ පාලනයක් ලෙස සැලකුවෙමු. Fl සංඥාව මධ්‍යම කලාපය සහ ප්‍රිමෝඩියම් ඇතුළුව SAM පුරා බෙදා හරින ලදී, නමුත් අඩු තීව්‍රතාවයකින් (රූපය 4j සහ අතිරේක රූපය 10d). ඊට වෙනස්ව, GA-Fl තුනම විශේෂයෙන් ප්‍රිමෝඩියම් මායිම් තුළ සහ ඉතිරි IPR හි විවිධ මට්ටම්වලට එකතු විය, GA7-Fl IPR හි විශාලතම වසම තුළ එකතු විය (රූපය 4k සහ අතිරේක රූපය 10a,b). ප්‍රතිදීප්ත තීව්‍රතාවයේ ප්‍රමාණනය කිරීමෙන් හෙළි වූයේ Fl-ප්‍රතිකාර කළ SAM හා සසඳන විට GA-Fl-ප්‍රතිකාර කළ SAM හි IPR සිට IPR නොවන තීව්‍රතා අනුපාතය වැඩි බවයි (රූපය 4l සහ අතිරේක රූපය 10c). එක්ව, මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ ඉන්ද්‍රිය මායිමට ආසන්නව පිහිටා ඇති IPR සෛලවල GA ඉහළ සාන්ද්‍රණයක පවතින බවයි. මෙයින් ඇඟවෙන්නේ SAM GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරකම් රටාව, ඉන්ද්‍රිය මායිම් අසල IPR සෛලවල GA ප්‍රතිග්‍රාහකවල අවකල ප්‍රකාශනය සහ GA අවකල සමුච්චය යන දෙකෙහිම ප්‍රතිඵලයක් බවයි. මේ අනුව, අපගේ විශ්ලේෂණයෙන් GA සංඥාකරණයේ අනපේක්ෂිත අවකාශීය-කාලික රටාවක් අනාවරණය වූ අතර, SAM මධ්‍යයේ සහ ප්‍රාථමික ප්‍රදේශයේ අඩු ක්‍රියාකාරිත්වයක් සහ පර්යන්ත කලාපයේ IPR හි ඉහළ ක්‍රියාකාරිත්වයක් දක්නට ලැබුණි.
SAM හි අවකල GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වයේ භූමිකාව තේරුම් ගැනීම සඳහා, අපි SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS හි තත්‍ය කාලීන කාල-අඩුපාඩු රූපකරණය භාවිතයෙන් GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය, සෛල ප්‍රසාරණය සහ සෛල බෙදීම අතර සහසම්බන්ධය විශ්ලේෂණය කළෙමු. වර්ධන නියාමනයේ GA හි භූමිකාව සැලකිල්ලට ගෙන, සෛල ප්‍රසාරණ පරාමිතීන් සමඟ ධනාත්මක සහසම්බන්ධයක් අපේක්ෂා කරන ලදී. එබැවින්, අපි මුලින්ම GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරකම් සිතියම් සෛල මතුපිට වර්ධන අනුපාතයේ සිතියම් සමඟ සංසන්දනය කළෙමු (දී ඇති සෛලයක් සඳහා සෛල ප්‍රසාරණ ශක්තිය සඳහා ප්‍රොක්සියක් ලෙස සහ බෙදීමේදී දියණිය සෛල සඳහා) සහ සෛල ප්‍රසාරණයේ දිශානතිය මනින වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි සිතියම් සමඟ (දී ඇති සෛලයක් සඳහා සහ බෙදීමේදී දියණිය සෛල සඳහා ද මෙහි භාවිතා වේ; රූපය 5a,b, ක්‍රම සහ අතිරේක ක්‍රම බලන්න). SAM සෛල මතුපිට වර්ධන අනුපාතයේ අපගේ සිතියම් පෙර නිරීක්ෂණ සමඟ අනුකූල වේ38,39, මායිමේ අවම වර්ධන අනුපාත සහ වර්ධනය වන මල් වල උපරිම වර්ධන අනුපාත සමඟ (රූපය 5a). ප්‍රධාන සංරචක විශ්ලේෂණය (PCA) පෙන්නුම් කළේ GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය සෛල මතුපිට වර්ධන තීව්‍රතාවය සමඟ සෘණාත්මකව සහසම්බන්ධ වී ඇති බවයි (රූපය 5c). GA සංඥා ආදානය සහ වර්ධන තීව්‍රතාවය ඇතුළුව විචලනයේ ප්‍රධාන අක්ෂ, ඉහළ CLV3 ප්‍රකාශනය මගින් තීරණය කරන ලද දිශාවට විකලාංග බව අපි පෙන්වා දුන්නෙමු, ඉතිරි විශ්ලේෂණයන්හි SAM මධ්‍යස්ථානයෙන් සෛල බැහැර කිරීම තහවුරු කළේය. ස්පියර්මන් සහසම්බන්ධතා විශ්ලේෂණය PCA ප්‍රතිඵල තහවුරු කළේය (රූපය 5d), IPR හි ඉහළ GA සංඥා ඉහළ සෛල ප්‍රසාරණයකට හේතු නොවූ බව පෙන්නුම් කරයි. කෙසේ වෙතත්, සහසම්බන්ධතා විශ්ලේෂණය GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වය සහ වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි අතර සුළු ධනාත්මක සහසම්බන්ධයක් හෙළි කළේය (රූපය 5c, d), IPR හි ඉහළ GA සංඥාකරණය සෛල වර්ධනයේ දිශාවට සහ සමහර විට සෛල බෙදීමේ තලයේ ස්ථානයට බලපෑම් කරන බව යෝජනා කරයි.
a, b SAM හි සාමාන්‍ය මතුපිට වර්ධනය (a) සහ වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි (b) තාප සිතියම් සාමාන්‍යයෙන් ස්වාධීන ශාක හතකට වඩා (පිළිවෙලින් සෛල ප්‍රසාරණයේ ශක්තිය සහ දිශාව සඳහා ප්‍රොක්සි ලෙස භාවිතා කරයි). c PCA විශ්ලේෂණයට පහත විචල්‍යයන් ඇතුළත් විය: GA සංඥාව, මතුපිට වර්ධන තීව්‍රතාවය, මතුපිට වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි සහ CLV3 ප්‍රකාශනය. PCA සංරචකය 1 ප්‍රධාන වශයෙන් මතුපිට වර්ධන තීව්‍රතාවය සමඟ සෘණාත්මකව සහසම්බන්ධ වූ අතර GA සංඥාව සමඟ ධනාත්මකව සහසම්බන්ධ විය. PCA සංරචකය 2 ප්‍රධාන වශයෙන් මතුපිට වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි සමඟ ධනාත්මකව සහසම්බන්ධ වූ අතර CLV3 ප්‍රකාශනය සමඟ සෘණාත්මකව සහසම්බන්ධ විය. ප්‍රතිශතයන් එක් එක් සංරචකය මගින් පැහැදිලි කරන ලද විචලනය නියෝජනය කරයි. d CZ හැර පටක පරිමාණයෙන් GA සංඥාව, මතුපිට වර්ධන තීව්‍රතාවය සහ මතුපිට වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි අතර ස්පියර්මන් සහසම්බන්ධතා විශ්ලේෂණය. දකුණු පස ඇති අංකය විචල්‍ය දෙකක් අතර ස්පියර්මන් rho අගයයි. සහසම්බන්ධය/සෘණ සහසම්බන්ධය ඉතා වැදගත් වන අවස්ථා තරු ලකුණු වලින් දැක්වේ. e confocal අන්වීක්ෂය මගින් Col-0 SAM L1 සෛල 3D දෘශ්‍යකරණය. SAM හි (නමුත් ප්‍රිමෝඩියම් නොවේ) පැය 10 කදී සාදන ලද නව සෛල බිත්ති ඒවායේ කෝණ අගයන් අනුව වර්ණ ගැන්වේ. වර්ණ තීරුව පහළ දකුණු කෙළවරේ දක්වා ඇත. ඇතුළත් කිරීම පැය 0 කදී අනුරූප ත්‍රිමාණ රූපය පෙන්වයි. අත්හදා බැලීම දෙවරක් පුනරාවර්තනය කරන ලද අතර සමාන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී. f කොටු බිම් කොටස් IPR සහ IPR නොවන Col-0 SAM හි සෛල බෙදීම් අනුපාත පෙන්වයි (n = ස්වාධීන ශාක 10). මධ්‍ය රේඛාව මධ්‍යය පෙන්වන අතර කොටු මායිම් 25 වන සහ 75 වන ප්‍රතිශතයන් දක්වයි. R මෘදුකාංගය සමඟ තීරණය කරන ලද අවම සහ උපරිම අගයන් උඩු රැවුලින් දැක්වේ. P අගයන් වෙල්ච්ගේ ද්වි-වලිග t-පරීක්ෂණය සමඟ ලබා ගන්නා ලදී. g, h SAM මධ්‍යයේ සිට රේඩියල් දිශාවට සාපේක්ෂව නව සෛල බිත්තියේ (මැජෙන්ටා) කෝණය (g) මැනිය යුතු ආකාරය පෙන්වන ක්‍රමානුරූප රූප සටහන (සුදු තිත් රේඛාව) (උග්‍ර කෝණ අගයන් පමණක්, එනම්, 0-90°, සලකා බලනු ලැබේ), සහ (h) මෙරිස්ටම් තුළ පරිධිය/පාර්ශ්වික සහ රේඩියල් දිශාවන්. i SAM (තද නිල්), IPR (මධ්‍යම නිල්) සහ IPR නොවන (ලා නිල්) හරහා සෛල බෙදීමේ තල දිශානතියේ සංඛ්‍යාත හිස්ටෝග්‍රෑම් පිළිවෙලින්. P අගයන් වලිග දෙකේ කොල්මොගොරොව්-ස්මිර්නොව් පරීක්ෂණයකින් ලබා ගන්නා ලදී. අත්හදා බැලීම දෙවරක් සමාන ප්‍රතිඵල සමඟ නැවත නැවතත් කරන ලදී. j පිළිවෙලින් P3 (ලා කොළ), P4 (මධ්‍යම කොළ) සහ P5 (තද කොළ) වටා ඇති IPR හි සෛල බෙදීමේ තල දිශානතියේ සංඛ්‍යාත හිස්ටෝග්‍රෑම්. P අගයන් වලිග දෙකේ කොල්මොගොරොව්-ස්මිර්නොව් පරීක්ෂණයකින් ලබා ගන්නා ලදී. සමාන ප්‍රතිඵල සමඟ අත්හදා බැලීම දෙවරක් නැවත නැවත කරන ලදී.
එමනිසා, අපි ඊළඟට GA සංඥාකරණය සහ සෛල බෙදීමේ ක්‍රියාකාරකම් අතර සහසම්බන්ධය පරීක්ෂා කළේ විශ්ලේෂණය අතරතුර අලුතින් සාදන ලද සෛල බිත්ති හඳුනා ගැනීමෙනි (රූපය 5e). මෙම ප්‍රවේශය අපට සෛල බෙදීමේ සංඛ්‍යාතය සහ දිශාව මැනීමට ඉඩ ලබා දුන්නේය. පුදුමයට කරුණක් නම්, IPR සහ ඉතිරි SAM (IPR නොවන, රූපය 5f) හි සෛල බෙදීම්වල සංඛ්‍යාතය සමාන බව අපට පෙනී ගිය අතර, IPR සහ IPR නොවන සෛල අතර GA සංඥාකරණයේ වෙනස්කම් සෛල බෙදීමට සැලකිය යුතු ලෙස බලපාන්නේ නැති බව පෙන්නුම් කරයි. මෙය සහ GA සංඥාකරණය සහ වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි අතර ධනාත්මක සහසම්බන්ධය, GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරකම් සෛල බෙදීමේ තලයේ දිශානතියට බලපෑම් කළ හැකිද යන්න සලකා බැලීමට අපව පොළඹවන ලදී. නව සෛල බිත්තියේ දිශානතිය අපි මෙරිස්ටම් මධ්‍යස්ථානය සහ නව සෛල බිත්තියේ මධ්‍යය සම්බන්ධ කරන රේඩියල් අක්ෂයට සාපේක්ෂව තියුණු කෝණයක් ලෙස මැන බැලුවෙමු (රූපය 5e-i) සහ රේඩියල් අක්ෂයට සාපේක්ෂව 90° ට ආසන්න කෝණවලින් සෛල බෙදීමට පැහැදිලි ප්‍රවණතාවක් නිරීක්ෂණය කළෙමු, ඉහළම සංඛ්‍යාත 70–80° (23.28%) සහ 80–90° (22.62%) (රූපය 5e,i) හි නිරීක්ෂණය කරන ලද අතර එය පරිධිය/තීර්යක් දිශාවේ සෛල බෙදීම් වලට අනුරූප වේ (රූපය 5h). මෙම සෛල බෙදීමේ හැසිරීමට GA සංඥාකරණයේ දායකත්වය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි IPR සහ IPR නොවන සෛල බෙදීම් පරාමිතීන් වෙන වෙනම විශ්ලේෂණය කළෙමු (රූපය 5i). IPR සෛලවල බෙදීම් කෝණ ව්‍යාප්තිය IPR නොවන සෛලවල හෝ සමස්ත SAM හි සෛලවල බෙදීම් කෝණ ව්‍යාප්තියට වඩා වෙනස් බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු, IPR සෛල පාර්ශ්වීය/චක්‍රාකාර සෛල බෙදීම්වල ඉහළ ප්‍රතිශතයක් පෙන්නුම් කරයි, එනම්, 70–80° සහ 80–90° (පිළිවෙලින් 33.86% සහ 30.71%, අනුරූප අනුපාතයන්) (රූපය 5i). මේ අනුව, අපගේ නිරීක්ෂණ මගින් ඉහළ GA සංඥාකරණය සහ පරිධි දිශාවට ආසන්න සෛල බෙදීම් තල දිශානතියක් අතර සම්බන්ධයක් අනාවරණය විය, එය GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය සහ වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි අතර සහසම්බන්ධයට සමානය (රූපය 5c, d). මෙම සම්බන්ධතාවයේ අවකාශීය සංරක්ෂණය තවදුරටත් තහවුරු කිරීම සඳහා, P4 සිට ආරම්භ වන මෙම කලාපයේ ඉහළම GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරකම් අනාවරණය වූ බැවින්, P3 සිට ආරම්භ වන ප්‍රාථමික ප්‍රදේශය වටා ඇති IPR සෛලවල බෙදීම් තල දිශානතිය අපි මැනිය (රූපය 4). P3 සහ P4 වටා ඇති IPR හි බෙදීම් කෝණ සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනස්කම් නොපෙන්වයි, නමුත් P4 වටා ඇති IPR හි පාර්ශ්වීය සෛල බෙදීම්වල වැඩි සංඛ්‍යාතයක් නිරීක්ෂණය විය (රූපය 5j). කෙසේ වෙතත්, P5 වටා ඇති IPR සෛලවල, සෛල බෙදීමේ තලයේ දිශානතියේ වෙනස සංඛ්‍යානමය වශයෙන් වැදගත් වූ අතර, තීර්යක් සෛල බෙදීම්වල සංඛ්‍යාතයේ තියුණු වැඩිවීමක් (රූපය 5j) සමඟින්. මෙම ප්‍රතිඵල එක්ව, GA සංඥාකරණයට SAM හි සෛල බෙදීම්වල දිශානතිය පාලනය කළ හැකි බව යෝජනා කරයි, එය පෙර වාර්තා වලට අනුකූල වේ40,41 ඉහළ GA සංඥාකරණයට IPR හි සෛල බෙදීම්වල පාර්ශ්වීය දිශානතිය ඇති කළ හැකිය.
IPR හි සෛල ප්‍රාථමික පටක වලට නොව අන්තඃස්ථිති වලට ඇතුළත් කරනු ඇතැයි පුරෝකථනය කර ඇත2,42,43. IPR හි සෛල බෙදීම්වල තීර්යක් දිශානතිය හේතුවෙන් අන්තඃස්ථිතිවල එපීඩර්මල් සෛලවල සමාන්තර කල්පවත්නා පේළි සාමාන්‍ය සංවිධානය වීමට හේතු විය හැක. ඉහත විස්තර කර ඇති අපගේ නිරීක්ෂණවලින් පෙනී යන්නේ සෛල බෙදීමේ දිශාව නියාමනය කිරීමෙන් GA සංඥාකරණය මෙම ක්‍රියාවලියේදී කාර්යභාරයක් ඉටු කරන බවයි.
DELLA ජාන කිහිපයක ක්‍රියාකාරිත්වය නැතිවීම නිසා ව්‍යුහාත්මක GA ප්‍රතිචාරයක් ඇති වන අතර, මෙම කල්පිතය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා ඩෙලා විකෘති භාවිතා කළ හැකිය44. අපි මුලින්ම SAM හි DELLA ජාන පහක ප්‍රකාශන රටා විශ්ලේෂණය කළෙමු. GUS රේඛාවේ පිටපත් කිරීමේ විලයනය45 හෙළි කළේ GAI, RGA, RGL1, සහ RGL2 (බොහෝ දුරට අඩු ප්‍රමාණයකට) SAM හි ප්‍රකාශිත බවයි (පරිපූරක රූපය 11a-d). ස්ථානීය දෙමුහුන්කරණය තවදුරටත් පෙන්නුම් කළේ GAI mRNA විශේෂයෙන් ප්‍රාථමික සහ වර්ධනය වන මල් වල එකතු වන බවයි (පරිපූරක රූපය 11e). SAM වියන පුරා සහ පැරණි මල් වල RGL1 සහ RGL3 mRNA අනාවරණය වූ අතර, RGL2 mRNA මායිම් කලාපයේ බහුලව තිබුණි (පරිපූරක රූපය 11f-h). pRGL3::RGL3-GFP SAM හි Confocal රූපකරණය ස්ථානීය දෙමුහුන්කරණය මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලද ප්‍රකාශනය තහවුරු කළ අතර SAM හි මධ්‍යම කොටසෙහි RGL3 ප්‍රෝටීන් එකතු වන බව පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක රූපය 11i). pRGA::GFP-RGA රේඛාව භාවිතා කරමින්, SAM තුළ RGA ප්‍රෝටීන් සමුච්චය වන බව අපට සොයා ගැනීමට හැකි විය, නමුත් P4 සිට ආරම්භ වන මායිමේදී එහි බහුලත්වය අඩු වේ (පරිපූරක රූපය 11j). සැලකිය යුතු ලෙස, RGL3 සහ RGA හි ප්‍රකාශන රටා qmRGA මගින් අනාවරණය කරගත් පරිදි IPR හි ඉහළ GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් සමඟ අනුකූල වේ (රූපය 4). එපමණක් නොව, මෙම දත්ත මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ සියලුම DELLAs SAM තුළ ප්‍රකාශ වන බවත් ඒවායේ ප්‍රකාශනය සාමූහිකව සමස්ත SAM පුරා විහිදෙන බවත්ය.
ඊළඟට අපි වල්-වර්ගයේ SAM (Ler, පාලනය) සහ gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (ගෝලීය) විකෘති වල සෛල බෙදීමේ පරාමිතීන් විශ්ලේෂණය කළෙමු (රූපය 6a, b). සිත්ගන්නා කරුණ නම්, වල් වර්ගයට සාපේක්ෂව ඩෙලා ගෝලීය විකෘති SAM හි සෛල බෙදීමේ කෝණ සංඛ්‍යාත ව්‍යාප්තියේ සංඛ්‍යානමය වශයෙන් සැලකිය යුතු වෙනසක් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 6c). ඩෙලා ගෝලීය විකෘතියේ මෙම වෙනසට හේතු වූයේ 80-90° කෝණවල සංඛ්‍යාතයේ වැඩිවීමක් (34.71% vs. 24.55%) සහ, අඩු ප්‍රමාණයකට, 70-80° කෝණ (23.78% vs. 20.18%), එනම්, තීර්යක් සෛල බෙදීම් වලට අනුරූප වීම (රූපය 6c). තීර්යක් නොවන බෙදීම්වල (0-60°) සංඛ්‍යාතය ඩෙලා ගෝලීය විකෘතියේ ද අඩු විය (රූපය 6c). ඩෙලා ගෝලීය විකෘතියේ SAM හි තීර්යක් සෛල බෙදීම්වල සංඛ්‍යාතය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි විය (රූපය 6b). IPR හි තීර්යක් සෛල බෙදීම්වල සංඛ්‍යාතය ඩෙලා ගෝලීය විකෘතියේ වල් වර්ගයට සාපේක්ෂව ද වැඩි විය (රූපය 6d). IPR කලාපයෙන් පිටත, වල් වර්ගයට සෛල බෙදීමේ කෝණවල වඩාත් ඒකාකාර ව්‍යාප්තියක් තිබූ අතර, ඩෙලා ගෝලීය විකෘතිය IPR වැනි ස්පර්ශක බෙදීම් වලට වැඩි කැමැත්තක් දැක්වීය (රූපය 6e). GA සමුච්චය වන GA-අක්‍රිය විකෘති පසුබිමක් වන ga2 ඔක්සිඩේස් (ga2ox) ක්වින්ටපල් විකෘති (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, සහ ga2ox6-2) හි SAM හි සෛල බෙදීම්වල දිශානතිය ද අපි ප්‍රමාණනය කළෙමු. GA මට්ටම්වල වැඩිවීමට අනුකූලව, quintuple ga2ox විකෘති පුෂ්ප මංජරියෙහි SAM Col-0 ට වඩා විශාල විය (පරිපූරක රූපය 12a, b), සහ Col-0 ට සාපේක්ෂව, quintuple ga2ox SAM සෛල බෙදීම් කෝණවල පැහැදිලිව වෙනස් ව්‍යාප්තියක් පෙන්නුම් කළේය, කෝණ සංඛ්‍යාතය 50° සිට 90° දක්වා වැඩි වීමත් සමඟ, එනම් නැවතත් ස්පර්ශක බෙදීම් වලට අනුග්‍රහය දක්වයි (පරිපූරක රූපය 12a–c). මේ අනුව, GA සංඥාකරණයේ සහ GA සමුච්චයේ ව්‍යුහාත්මක සක්‍රිය කිරීම IPR සහ SAM හි ඉතිරි කොටසෙහි පාර්ශ්වීය සෛල බෙදීම් ඇති කරන බව අපි පෙන්වමු.
a, b confocal අන්වීක්ෂය භාවිතයෙන් PI-පැල්ලම් කරන ලද Ler (a) සහ ගෝලීය della mutant (b) SAM හි L1 ස්ථරයේ 3D දෘශ්‍යකරණය. පැය 10 ක කාලයක් තුළ SAM (නමුත් ප්‍රිමෝඩියම් නොවේ) තුළ සාදන ලද නව සෛල බිත්ති පෙන්වා ඇති අතර ඒවායේ කෝණ අගයන් අනුව වර්ණ ගැන්වේ. ඇතුළත් කිරීම 0 h හි SAM පෙන්වයි. වර්ණ තීරුව පහළ දකුණු කෙළවරේ ප්‍රදර්ශනය කෙරේ. (b) හි ඊතලය ගෝලීය della mutant හි පෙළගස්වන ලද සෛල ගොනු වල උදාහරණයක් පෙන්වයි. සමාන ප්‍රතිඵල සමඟ අත්හදා බැලීම දෙවරක් පුනරාවර්තනය කරන ලදී. ce Ler සහ ගෝලීය della අතර මුළු SAM (d), IPR (e) සහ IPR නොවන (f) හි සෛල බෙදීමේ තල දිශානතියේ සංඛ්‍යාත ව්‍යාප්තිය සංසන්දනය කිරීම. වලිග දෙකකින් යුත් Kolmogorov-Smirnov පරීක්ෂණයක් භාවිතයෙන් P අගයන් ලබා ගන්නා ලදී. f, g Col-0 (i) සහ pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenic ශාකවල PI-පැල්ලම් කරන ලද SAM හි confocal රූපවල 3D දෘශ්‍යකරණය. (a, b) පැනල් මඟින් පැය 10ක් ඇතුළත SAM හි පිහිටුවා ඇති නව සෛල බිත්ති (නමුත් ප්‍රාථමික නොවේ) පෙන්වයි. අත්හදා බැලීම දෙවරක් නැවත නැවතත් කරන ලද අතර සමාන ප්‍රතිඵල ලැබුණි. h–j Col-0 සහ pCUC2::gai-1-VENUS ශාක අතර සම්පූර්ණ SAM (h), IPR (i) සහ IPR නොවන (j) හි පිහිටා ඇති සෛල බෙදීමේ තල දිශානතියේ සංඛ්‍යාත ව්‍යාප්තිය සංසන්දනය කිරීම. වලිග දෙකකින් යුත් Kolmogorov-Smirnov පරීක්ෂණයක් භාවිතයෙන් P අගයන් ලබා ගන්නා ලදී.
ඊළඟට අපි IPR හි විශේෂයෙන් GA සංඥාකරණය නිෂේධනය කිරීමේ බලපෑම පරීක්ෂා කළෙමු. මේ සඳහා, VENUS වෙත විලයනය වූ ප්‍රමුඛ සෘණ gai-1 ප්‍රෝටීනයක ප්‍රකාශනය ධාවනය කිරීම සඳහා අපි cotyledon cup 2 (CUC2) ප්‍රවර්ධකය භාවිතා කළෙමු (pCUC2::gai-1-VENUS රේඛාවේ). වල්-වර්ගයේ SAM හි, CUC2 ප්‍රවර්ධකය P4 සිට මායිම් සෛල ඇතුළුව SAM හි බොහෝ IPR වල ප්‍රකාශනය ධාවනය කරන අතර, pCUC2::gai-1-VENUS ශාකවල සමාන නිශ්චිත ප්‍රකාශනයක් නිරීක්ෂණය කරන ලදී (පහත බලන්න). pCUC2::gai-1-VENUS ශාකවල SAM හෝ IPR හරහා සෛල බෙදීමේ කෝණ බෙදා හැරීම වල් වර්ගයට වඩා සැලකිය යුතු ලෙස වෙනස් නොවූවත්, අනපේක්ෂිත ලෙස මෙම ශාකවල IPR නොමැති සෛල 80-90° ඉහළ සංඛ්‍යාතයකින් බෙදී ඇති බව අපට පෙනී ගියේය (රූපය 6f-j).
සෛල බෙදීමේ දිශාව SAM හි ජ්‍යාමිතිය මත රඳා පවතින බව යෝජනා වී ඇත, විශේෂයෙන් පටක වක්‍රතාවයෙන් ජනනය වන ආතන්ය ආතතිය46. එබැවින් අපි ඩෙලා ගෝලීය විකෘති සහ pCUC2::gai-1-VENUS ශාකවල SAM හි හැඩය වෙනස් වී ඇත්දැයි විමසුවෙමු. කලින් වාර්තා කළ පරිදි12, ඩෙලා ගෝලීය විකෘති SAM හි ප්‍රමාණය වල් වර්ගයට වඩා විශාල විය (පරිපූරක රූපය 13a, b, d). CLV3 සහ STM RNA හි ස්ථානීය දෙමුහුන්කරණය ඩෙලා විකෘති වල මෙරිස්ටම් ප්‍රසාරණය තහවුරු කළ අතර කඳ සෛල නිකේතනයේ පාර්ශ්වීය ප්‍රසාරණය තවදුරටත් පෙන්නුම් කළේය (පරිපූරක රූපය 13e, f, h, i). කෙසේ වෙතත්, SAM වක්‍රය ප්‍රවේණි වර්ග දෙකෙහිම සමාන විය (පරිපූරක රූපය 13k, m, n, p). වල් වර්ගයට සාපේක්ෂව වක්‍රතාවයේ වෙනසක් නොමැතිව gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant හි ප්‍රමාණයේ සමාන වැඩිවීමක් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (පරිපූරක රූපය 13c, d, g, j, l, o, p). සෛල බෙදීමේ දිශානතියේ සංඛ්‍යාතය della quadruple mutant හි ද බලපෑවේය, නමුත් della monoliptic mutant හි (පරිපූරක රූපය 12d-f) ට වඩා අඩු ප්‍රමාණයකට. මෙම මාත්‍රා බලපෑම, වක්‍රතාවයට බලපෑමක් නොමැතිකම සමඟින්, Della quadruple mutant හි අවශේෂ RGL3 ක්‍රියාකාරිත්වය DELLA ක්‍රියාකාරිත්වය නැතිවීම නිසා ඇතිවන සෛල බෙදීමේ දිශානතියේ වෙනස්කම් සීමා කරන බවත්, SAM ජ්‍යාමිතියේ වෙනස්කම් වලට වඩා GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වයේ වෙනස්කම් වලට ප්‍රතිචාර වශයෙන් පාර්ශ්වීය සෛල බෙදීම්වල වෙනස්කම් සිදුවන බවත් යෝජනා කරයි. ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි, CUC2 ප්‍රවර්ධකය P4 සිට ආරම්භ වන SAM හි IPR ප්‍රකාශනය ධාවනය කරයි (පරිපූරක රූපය 14a, b), සහ ඊට ප්‍රතිවිරුද්ධව, pCUC2::gai-1-VENUS SAM හි ප්‍රමාණය අඩු වූ නමුත් ඉහළ වක්‍රතාවයක් තිබුණි (පරිපූරක රූපය 14c-h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM රූප විද්‍යාවේ මෙම වෙනස වල් වර්ගයට සාපේක්ෂව යාන්ත්‍රික ආතතීන්හි වෙනස් ව්‍යාප්තියකට හේතු විය හැක, එහිදී ඉහළ පරිපූරක ආතතීන් SAM මධ්‍යස්ථානයෙන් කෙටි දුරකින් ආරම්භ වේ47. විකල්පයක් ලෙස, pCUC2::gai-1-VENUS SAM රූප විද්‍යාවේ වෙනස්කම් ට්‍රාන්ස්ජීන් ප්‍රකාශනය මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද කලාපීය යාන්ත්‍රික ගුණාංගවල වෙනස්කම් නිසා විය හැක48. අවස්ථා දෙකේදීම, මෙය අපගේ නිරීක්ෂණ පැහැදිලි කරමින්, පරිපූරක/තීර්යක් දිශානතියේදී සෛල බෙදීමේ සම්භාවිතාව වැඩි කිරීමෙන් GA සංඥාකරණයේ වෙනස්කම්වල බලපෑම් අර්ධ වශයෙන් සමනය කළ හැකිය.
එකට ගත් කල, අපගේ දත්ත සනාථ කරන්නේ ඉහළ GA සංඥාකරණය IPR හි සෛල බෙදීමේ තලයේ පාර්ශ්වීය දිශානතියට ක්‍රියාකාරී භූමිකාවක් ඉටු කරන බවයි. තවද, මෙරිස්ටම් වක්‍රය IPR හි සෛල බෙදීමේ තලයේ දිශානතියට බලපෑම් කරන බව ඔවුන් පෙන්වා දෙයි.
ඉහළ GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය හේතුවෙන් IPR හි බෙදීම් තලයේ තීර්යක් දිශානතිය, GA විසින් SAM තුළ එපීඩර්මිස් හි රේඩියල් සෛල ගොනුවක් පූර්ව-සංවිධානය කරන බව යෝජනා කරයි, එය පසුව එපීඩර්මල් ඉන්ටර්නෝඩයේ සොයා ගත හැකි සෛලීය සංවිධානය නිර්වචනය කරයි. ඇත්ත වශයෙන්ම, එවැනි සෛල ගොනු ඩෙලා ගෝලීය විකෘති වල SAM රූපවල නිතර දක්නට ලැබුණි (රූපය 6b). මේ අනුව, SAM හි GA සංඥාකරණයේ අවකාශීය රටාවේ සංවර්ධන ක්‍රියාකාරිත්වය තවදුරටත් ගවේෂණය කිරීම සඳහා, අපි වල්-වර්ගයේ (Ler සහ Col-0), ඩෙලා ගෝලීය විකෘති සහ pCUC2::gai-1-VENUS transgenic ශාකවල IPR හි සෛලවල අවකාශීය සංවිධානය විශ්ලේෂණය කිරීමට කාල-ලැප්ස් රූපකරණය භාවිතා කළෙමු.
qmRGA මගින් IPR හි GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වය P1/P2 සිට වැඩි වී P4 හි උපරිමයට පැමිණි බව අපට පෙනී ගිය අතර, මෙම රටාව කාලයත් සමඟ නියතව පැවතුනි (රූපය 4a–f සහ අතිරේක රූපය 8c–f, k). වැඩිවන GA සංඥාව සමඟ IPR හි සෛලවල අවකාශීය සංවිධානය විශ්ලේෂණය කිරීම සඳහා, අපි පළමු නිරීක්ෂණයෙන් පැය 34 කට පසු විශ්ලේෂණය කරන ලද ඒවායේ සංවර්ධන ඉරණම අනුව P4 හි ඉහළින් සහ පැතිවලට Ler IPR සෛල ලේබල් කළෙමු, එනම්, P1/P2 සිට P4 දක්වා ප්‍රාථමික සංවර්ධනයේදී IPR සෛල අනුගමනය කිරීමට අපට ඉඩ සලසයි. අපි වෙනස් වර්ණ තුනක් භාවිතා කළෙමු: P4 අසල ප්‍රාථමිකයට ඒකාබද්ධ කරන ලද සෛල සඳහා කහ, IPR හි තිබූ සෛල සඳහා කොළ සහ ක්‍රියාවලීන් දෙකටම සහභාගී වූ සෛල සඳහා දම් පාට (රූපය 7a–c). t0 (0 h) හිදී, P4 ඉදිරිපිට IPR සෛල ස්ථර 1-2 ක් දෘශ්‍යමාන විය (රූපය 7a). අපේක්ෂා කළ පරිදි, මෙම සෛල බෙදී ගිය විට, ඒවා ප්‍රධාන වශයෙන් තීර්යක් බෙදීමේ තලය හරහා සිදු විය (රූපය 7a–c). Col-0 SAM භාවිතයෙන් සමාන ප්‍රතිඵල ලබා ගන්නා ලදී (P3 කෙරෙහි අවධානය යොමු කරමින්, එහි මායිම Ler හි P4 ට සමානව නැමෙයි), නමුත් මෙම ප්‍රවේණික මාදිලියේ මල් මායිමේ පිහිටුවා ඇති නැමීම IPR සෛල වඩාත් ඉක්මනින් සඟවා ඇත (රූපය 7g–i). මේ අනුව, IPR සෛලවල බෙදීමේ රටාව අන්තර් නෝඩ් වල මෙන්, රේඩියල් පේළි වලට සෛල පූර්ව-සංවිධානය කරයි. රේඩියල් පේළි සංවිධානය කිරීම සහ අනුප්‍රාප්තික අවයව අතර IPR සෛල ස්ථානගත කිරීම මෙම සෛල අභ්‍යන්තර නෝඩල් පූර්වගාමීන් බව යෝජනා කරයි.
මෙහිදී, අපි අනුපාතමිතික GA සංඥා ජෛව සංවේදකයක්, qmRGA සංවර්ධනය කළෙමු, එය ඒකාබද්ධ GA සහ GA ප්‍රතිග්‍රාහක සාන්ද්‍රණයන්ගෙන් ලැබෙන GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රමාණාත්මකව සිතියම්ගත කිරීමට ඉඩ සලසන අතරම අන්තරාසර්ග සංඥා මාර්ග සමඟ බාධා අවම කරන අතර එමඟින් සෛලීය මට්ටමින් GA ක්‍රියාකාරිත්වය පිළිබඳ තොරතුරු සපයයි. මේ සඳහා, අපි වෙනස් කරන ලද DELLA ප්‍රෝටීනයක්, mRGA ගොඩනඟා ගත් අතර එය DELLA අන්තර්ක්‍රියා හවුල්කරුවන් බැඳ තැබීමේ හැකියාව නැති කර ගත් නමුත් GA-ප්‍රේරිත ප්‍රෝටියෝලිසිස් වලට සංවේදීව පවතී. qmRGA GA මට්ටම්වල බාහිර සහ අන්තරාසර්ග වෙනස්කම් දෙකටම ප්‍රතිචාර දක්වන අතර, එහි ගතික සංවේදක ගුණාංග සංවර්ධනය අතරතුර GA සංඥා ක්‍රියාකාරකම්වල අවකාශීය-කාලික වෙනස්කම් තක්සේරු කිරීමට හැකියාව ලබා දෙයි. qmRGA ඉතා නම්‍යශීලී මෙවලමක් වන අතර එය එහි ප්‍රකාශනය සඳහා භාවිතා කරන ප්‍රවර්ධකය වෙනස් කිරීමෙන් (අවශ්‍ය නම්) විවිධ පටක වලට අනුවර්තනය කළ හැකි අතර, GA සංඥා මාර්ගයේ සංරක්ෂිත ස්වභාවය සහ ඇන්ජියෝස්පර්ම් හරහා PFYRE මෝස්තරය ලබා දී ඇති බැවින්, එය අනෙකුත් විශේෂවලට මාරු කළ හැකිය22. මෙයට අනුකූලව, සහල් SLR1 DELLA ප්‍රෝටීනයේ (HYY497AAA) සමාන විකෘතියක් SLR1 හි වර්ධන මර්දන ක්‍රියාකාරිත්වය මර්දනය කරන අතර mRGA23 ට සමානව එහි GA-මැදිහත් වූ පරිහානිය තරමක් අඩු කරන බව පෙන්වා දෙන ලදී. විශේෂයෙන්, Arabidopsis හි මෑත කාලීන අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දුන්නේ PFYRE වසමේ (S474L) තනි ඇමයිනෝ අම්ල විකෘතියක් RGA හි පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාකාරිත්වය වෙනස් කළේ පිටපත් කිරීමේ සාධක හවුල්කරුවන් සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කිරීමේ හැකියාවට බලපෑම් නොකර බවයි. මෙම විකෘතිය mRGA හි පවතින ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශක 3 ට ඉතා ආසන්න වුවද, අපගේ අධ්‍යයනවලින් පෙනී යන්නේ මෙම විකෘති දෙක DELLA හි සුවිශේෂී ලක්ෂණ වෙනස් කරන බවයි. බොහෝ පිටපත් කිරීමේ සාධක හවුල්කරුවන් DELLA26,51 හි LHR1 සහ SAW වසම් වලට බන්ධනය වුවද, PFYRE වසමේ සමහර සංරක්ෂිත ඇමයිනෝ අම්ල මෙම අන්තර්ක්‍රියා ස්ථාවර කිරීමට උපකාරී විය හැකිය.
ශාක ගෘහ නිර්මාණ ශිල්පයේ සහ අස්වැන්න වැඩි දියුණු කිරීමේ ප්‍රධාන ලක්ෂණයක් වන්නේ ඉන්ටර්නෝඩ් සංවර්ධනයයි. qmRGA විසින් IPR ඉන්ටර්නෝඩ් ප්‍රොජෙනිටර් සෛලවල ඉහළ GA සංඥා ක්‍රියාකාරිත්වය හෙළි කරන ලදී. ප්‍රමාණාත්මක රූපකරණය සහ ජාන විද්‍යාව ඒකාබද්ධ කිරීමෙන්, GA සංඥා රටා SAM එපීඩර්මිස් හි චක්‍රලේඛ/තීර්යක් සෛල බෙදීම් තල අධිස්ථාපනය කරන බවත්, ඉන්ටර්නෝඩ් සංවර්ධනය සඳහා අවශ්‍ය සෛල බෙදීම් සංවිධානය හැඩගස්වන බවත් අපි පෙන්වා දුන්නෙමු. සංවර්ධනය අතරතුර සෛල බෙදීම් තල දිශානතියේ නියාමකයින් කිහිපයක් හඳුනාගෙන ඇත52,53. GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වය මෙම සෛලීය පරාමිතිය නියාමනය කරන ආකාරය පිළිබඳ පැහැදිලි උදාහරණයක් අපගේ කාර්යය සපයයි. DELLA හට පූර්ව නැමෙන ප්‍රෝටීන් සංකීර්ණ සමඟ අන්තර් ක්‍රියා කළ හැකිය41, එබැවින් GA සංඥාකරණය බාහික ක්ෂුද්‍ර නල දිශානතියට සෘජුවම බලපෑම් කිරීමෙන් සෛල බෙදීම් තල දිශානතිය නියාමනය කළ හැකිය40,41,54,55. අපි අනපේක්ෂිත ලෙස SAM හි ඉහළ GA සංඥාකරණ ක්‍රියාකාරිත්වයේ සහසම්බන්ධය සෛල දිගු කිරීම හෝ බෙදීම නොව, IPR හි සෛල බෙදීමේ දිශාවට GA හි සෘජු බලපෑමට අනුකූල වන වර්ධන ඇනිසොට්‍රොපි පමණක් බව අපි පෙන්වා දුන්නෙමු. කෙසේ වෙතත්, මෙම බලපෑම වක්‍ර විය හැකි බව අපට බැහැර කළ නොහැක, උදාහරණයක් ලෙස GA-ප්‍රේරිත සෛල බිත්ති මෘදු කිරීම මගින් මැදිහත් වීම56. සෛල බිත්ති ගුණාංගවල වෙනස්කම් යාන්ත්‍රික ආතතිය ඇති කරයි57,58, එය බාහික ක්ෂුද්‍ර නලවල දිශානතියට බලපෑම් කිරීමෙන් සෛල බෙදීමේ තලයේ දිශානතියට ද බලපෑම් කළ හැකිය39,46,59. GA-ප්‍රේරිත යාන්ත්‍රික ආතතියේ ඒකාබද්ධ බලපෑම් සහ GA මගින් ක්ෂුද්‍ර නල දිශානතිය සෘජුවම නියාමනය කිරීම, අන්තර් නෝඩ් නිර්වචනය කිරීම සඳහා IPR හි සෛල බෙදීමේ දිශානතියේ නිශ්චිත රටාවක් ජනනය කිරීමට සම්බන්ධ විය හැකි අතර, මෙම අදහස පරීක්ෂා කිරීම සඳහා වැඩිදුර අධ්‍යයනයන් අවශ්‍ය වේ. ඒ හා සමානව, පෙර අධ්‍යයනයන් මගින් අන්තර් නෝඩ් සෑදීම පාලනය කිරීමේදී DELLA-අන්තර්ක්‍රියා කරන ප්‍රෝටීන TCP14 සහ 15 හි වැදගත්කම ඉස්මතු කර ඇති අතර මෙම සාධක අන්තර් නෝඩ් සංවර්ධනය නියාමනය කරන සහ GA සංඥාකරණයට බලපෑම් කරන බව පෙන්වා දී ඇති BREVIPEDICELLUS (BP) සහ PENNYWISE (PNY) සමඟ GA හි ක්‍රියාකාරිත්වය මැදිහත් විය හැකිය2,62. DELLAs බ්‍රැසිනොස්ටෙරොයිඩ්, එතිලීන්, ජැස්මොනික් අම්ලය සහ අබ්සිසික් අම්ලය (ABA) සංඥා මාර්ග සමඟ අන්තර්ක්‍රියා කරන බවත් මෙම හෝමෝන ක්ෂුද්‍ර නල දිශානතියට බලපෑම් කළ හැකි බවත්63,64 සලකන විට, සෛල බෙදීමේ දිශානතියට GA හි බලපෑම් අනෙකුත් හෝමෝන මගින් ද මැදිහත් විය හැකිය.
මුල් කාලීන සෛල විද්‍යාත්මක අධ්‍යයනවලින් පෙනී ගියේ, Arabidopsis SAM හි අභ්‍යන්තර සහ බාහිර ප්‍රදේශ දෙකම අභ්‍යන්තර සංවර්ධනය සඳහා අවශ්‍ය බවයි2,42. GA අභ්‍යන්තර පටක වල සෛල බෙදීම සක්‍රීයව නියාමනය කරන බව12, SAM හි මෙරිස්ටම් සහ අභ්‍යන්තර ප්‍රමාණය නියාමනය කිරීමේදී GA හි ද්විත්ව ක්‍රියාකාරිත්වයට සහාය වේ. දිශානුගත සෛල බෙදීමේ රටාව අභ්‍යන්තර SAM පටක වල ද දැඩි ලෙස නියාමනය කර ඇති අතර, මෙම නියාමනය කඳ වර්ධනය සඳහා අත්‍යවශ්‍ය වේ52. අභ්‍යන්තර SAM සංවිධානයේ සෛල බෙදීමේ තලය දිශානතියට පත් කිරීමේදී GA ද කාර්යභාරයක් ඉටු කරන්නේද යන්න පරීක්ෂා කිරීම සිත්ගන්නා කරුණකි, එමඟින් SAM තුළ අභ්‍යන්තර නෝඩ් වල පිරිවිතර සහ සංවර්ධනය සමමුහුර්ත කරයි.
සම්මත තත්ව යටතේ (පැය 16 ආලෝකය, 22 °C) 1% සුක්‍රෝස් සහ 1% ඒගාර් (සිග්මා) සමඟ අතිරේකව පසෙහි හෝ 1x මුරෂිගේ-ස්කූග් (MS) මාධ්‍යය (ඩුචෙෆා) තුළ ශාක වගා කරන ලදී. නියත ආලෝකය සහ 22 °C යටතේ සිරස් තහඩු මත බීජ පැල වගා කරන ලද හයිපොකොටයිල් සහ මූල වර්ධන අත්හදා බැලීම් හැර. නයිට්‍රේට් අත්හදා බැලීම් සඳහා, දිගු දින තත්වයන් යටතේ ප්‍රමාණවත් නයිට්‍රේට් (0 හෝ 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% සුක්‍රෝස් සහ 1% A-ඒගාර් (සිග්මා) සමඟ අතිරේකව වෙනස් කරන ලද MS මාධ්‍යය (bioWORLD ශාක මාධ්‍යය) මත ශාක වගා කරන ලදී.
pDONR221 තුළට ඇතුළු කරන ලද GID1a cDNA, pDONR P4-P1R-pUBQ10 සහ pDONR P2R-P3-mCherry සමඟ pB7m34GW තුළට නැවත ඒකාබද්ධ කර pUBQ10::GID1a-mCherry ජනනය කරන ලදී. pDONR221 තුළට ඇතුළු කරන ලද IDD2 DNA, pB7RWG266 තුළට නැවත ඒකාබද්ධ කර p35S:IDD2-RFP ජනනය කරන ලදී. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ජනනය කිරීම සඳහා, GID1b කේතීකරණ කලාපයේ ඉහළට 3.9 kb කැබැල්ලක් සහ GID1b cDNA (1.3 kb) සහ ටර්මිනේටර් (3.4 kb) අඩංගු 4.7 kb කැබැල්ලක් පළමුව අතිරේක වගුව 3 හි ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් විස්තාරණය කර, පසුව පිළිවෙලින් pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) සහ pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) තුළට ඇතුළු කරන ලද අතර, අවසානයේ pDONR221 2xmTQ268 සමඟ pGreen 012567 ඉලක්ක දෛශිකයට ගේට්වේ ක්ලෝනකරණය භාවිතයෙන් නැවත ඒකාබද්ධ කරන ලදී. pCUC2::LSSmOrange ජනනය කිරීම සඳහා, CUC2 ප්‍රවර්ධක අනුපිළිවෙල (ATG හි ඉහළට 3229 bp) සහ N7 න්‍යෂ්ටික ප්‍රාදේශීයකරණ සංඥාව සහිත විශාල Stokes-මාරු කරන ලද mOrange (LSSmOrange)69 හි කේතීකරණ අනුපිළිවෙල සහ NOS පිටපත් කිරීමේ පර්යන්තකය Gateway 3-fragment recombination system (Invitrogen) භාවිතයෙන් pGreen kanamycin ඉලක්කගත දෛශිකයට එකලස් කරන ලදී. ශාක ද්විමය දෛශිකය Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 වෙත හඳුන්වා දෙන ලද අතර Agrobacterium infiltration ක්‍රමය මගින් Nicotiana benthamiana කොළ වලට සහ මල් ඩිප් ක්‍රමය මගින් Arabidopsis thaliana Col-0 වෙත පිළිවෙලින් හඳුන්වා දෙන ලදී. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry සහ pCLV3::mCherry-NLS qmRGA පිළිවෙලින් අදාළ කුරුසවල F3 සහ F1 පරම්පරාවෙන් හුදකලා කරන ලදී.
ආසන්න වශයෙන් සෙන්ටිමීටර 1 ක් දිග අංකුර ඉඟි මත RNA ස්ථානීය දෙමුහුන්කරණය සිදු කරන ලද අතර, ඒවා එකතු කර වහාම FAA ද්‍රාවණයක (3.7% ෆෝමල්ඩිහයිඩ්, 5% ඇසිටික් අම්ලය, 50% එතනෝල්) 4 °C ට පෙර සිසිල් කරන ලදී. මිනිත්තු 2 × 15 ක රික්ත ප්‍රතිකාරවලින් පසු, සවිකාරකය වෙනස් කරන ලද අතර සාම්පල එක රැයකින් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, සහ RGL3 cDNA සහ ඒවායේ 3′-UTR වලට ප්‍රති-සංවේදක පරීක්ෂණ Rosier et al.73 විසින් විස්තර කර ඇති පරිදි අතිරේක වගුව 3 හි පෙන්වා ඇති ප්‍රයිමර් භාවිතයෙන් සංස්ලේෂණය කරන ලදී. ඩිගොක්සිජෙනින් ලේබල් කරන ලද පරීක්ෂණ ඩිගොක්සිජෙනින් ප්‍රතිදේහ (3000-ගුණයකින් තනුක කිරීම; රොචේ, නාමාවලි අංකය: 11 093 274 910) භාවිතයෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ අනාවරණය කරන ලද අතර, කොටස් 5-බ්‍රෝමෝ-4-ක්ලෝරෝ-3-ඉන්ඩොලයිල් පොස්පේට් (BCIP, 250-ගුණයකින් තනුක කිරීම)/නයිට්‍රොබ්ලූ ටෙට්‍රසෝලියම් (NBT, 200-ගුණයකින් තනුක කිරීම) ද්‍රාවණයකින් වර්ණ ගැන්වීය.