ශාක ක්ෂුද්‍ර නල වලට බලපාන නව ශාක වර්ධන නිෂේධක ලෙස උර්සා මොනොඇමයිඩ් සොයා ගැනීම, සංලක්ෂිත කිරීම සහ ක්‍රියාකාරී වැඩිදියුණු කිරීම.

Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තූතියි. ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රව්සර් අනුවාදයේ සීමිත CSS සහාය ඇත. හොඳම ප්‍රතිඵල සඳහා, ඔබගේ බ්‍රව්සරයේ නවතම අනුවාදයක් භාවිතා කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රීය කරන්න). මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි මෝස්තරයක් හෝ JavaScript නොමැතිව අඩවිය පෙන්වමු.
ස්වාභාවික නිෂ්පාදන සොයා ගැනීම සහ ප්‍රයෝජනවත් ලෙස භාවිතා කිරීම මිනිස් ජීවිතය වැඩිදියුණු කිරීමට උපකාරී වේ. වල් පැලෑටි පාලනය කිරීම සඳහා ශාක වර්ධනය වළක්වන රසායනික ද්‍රව්‍ය වල් නාශක ලෙස බහුලව භාවිතා වේ. විවිධ වර්ගයේ වල් නාශක භාවිතා කිරීමේ අවශ්‍යතාවය නිසා, නව ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණ සහිත සංයෝග හඳුනා ගැනීමේ අවශ්‍යතාවයක් පවතී. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි Streptomyces werraensis MK493-CF1 වෙතින් නව N-alkoxypyrrole සංයෝගයක් වන coumamonamide සොයා ගත් අතර සම්පූර්ණ සංස්ලේෂණ ක්‍රියාවලිය ස්ථාපිත කළෙමු. ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් පරීක්ෂණ හරහා, අපි urs-monoamic අම්ලය urs-monoamide හි කෘතිම අතරමැදියක් සහ විභවයක් බව සොයා ගත්තෙමු.ශාක වර්ධන නිෂේධකය. ඊට අමතරව, අපි HeLa සෛල වර්ධනයට අහිතකර ලෙස බලපාන්නේ නැතිව ඉහළ වල්නාශක ක්‍රියාකාරිත්වයක් ඇති urbenyloxy ව්‍යුත්පන්නය (UDA) ඇතුළු විවිධ urbenonic අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් සංවර්ධනය කර ඇත්තෙමු. urmotonic අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් ශාක ක්ෂුද්‍ර නල වලට බාධා කරන බව ද අපි සොයා ගත්තෙමු; ඊට අමතරව, KAND ඇක්ටින් සූතිකා වලට බලපාන අතර සෛල මරණයට හේතු වේ; මෙම බහුවිධ බලපෑම් දන්නා ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධක වලින් වෙනස් වන අතර ursonic අම්ලය සඳහා ක්‍රියාකාරීත්වයේ නව යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරයි, එය නව වල් නාශක සංවර්ධනය කිරීමේදී වැදගත් වාසියක් නියෝජනය කරයි.
ප්‍රයෝජනවත් ස්වාභාවික නිෂ්පාදන සහ ඒවායේ ව්‍යුත්පන්නයන් සොයා ගැනීම සහ ප්‍රායෝගිකව යෙදීම මිනිස් ජීවිතයේ ගුණාත්මකභාවය වැඩිදියුණු කිරීමේ මාධ්‍යයකි. ක්ෂුද්‍ර ජීවීන්, ශාක සහ කෘමීන් විසින් නිපදවන ද්විතියික පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය වෛද්‍ය විද්‍යාවේ සහ කෘෂිකර්මාන්තයේ ප්‍රධාන දියුණුවට හේතු වී තිබේ. බොහෝ ප්‍රතිජීවක සහ ලියුකේමියා විරෝධී ඖෂධ ස්වාභාවික නිෂ්පාදන වලින් සංවර්ධනය කර ඇත. ඊට අමතරව, විවිධ වර්ගවලපළිබෝධනාශක, කෘෂිකර්මාන්තයේ භාවිතය සඳහා මෙම ස්වාභාවික නිෂ්පාදන වලින් දිලීර නාශක සහ වල්නාශක නිස්සාරණය කරනු ලැබේ. විශේෂයෙන්, වල් පැලෑටි පාලන වල්නාශක නූතන කෘෂිකර්මාන්තයේ බෝග අස්වැන්න වැඩි කිරීම සඳහා වැදගත් මෙවලම් වන අතර, විවිධ වර්ගයේ සංයෝග දැනටමත් වාණිජමය වශයෙන් භාවිතා වේ. ප්‍රභාසංස්ලේෂණය, ඇමයිනෝ අම්ල පරිවෘත්තීය, සෛල බිත්ති සංස්ලේෂණය, මයිටෝසිස් නියාමනය, ෆයිටෝහෝමෝන සංඥා කිරීම හෝ ප්‍රෝටීන් සංස්ලේෂණය වැනි ශාකවල සෛලීය ක්‍රියාවලීන් කිහිපයක් වල්නාශකවල සාමාන්‍ය ඉලක්ක ලෙස සැලකේ. ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වන සංයෝග යනු මයිටොටික් නියාමනයට බලපෑම් කිරීමෙන් ශාක වර්ධනයට බලපාන පොදු වල්නාශක පන්තියකි2.
ක්ෂුද්‍ර නල යනු සයිටොස්කෙලිටනයේ සංරචක වන අතර යුකැරියෝටික් සෛල තුළ බහුලව සංරක්ෂණය කර ඇත. ටියුබියුලින් හීටරෝඩයිමර් α-ටියුබියුලින් සහ β-ටියුබියුලින් වලින් සමන්විත වන අතර රේඛීය ක්ෂුද්‍ර නල ප්‍රොටෝෆිලමන්ට් සාදයි, ප්‍රොටෝෆිලමන්ට් 13 ක් සිලින්ඩරාකාර ව්‍යුහයක් සාදයි. සෛල හැඩය, සෛල බෙදීම සහ අන්තර් සෛලීය ප්‍රවාහනය තීරණය කිරීම ඇතුළුව ශාක සෛලවල ක්ෂුද්‍ර නල බහු භූමිකාවන් ඉටු කරයි3,4. ශාක සෛලවල අන්තර් අවධි ප්ලාස්මා පටලයට යටින් ක්ෂුද්‍ර නල අඩංගු වන අතර, මෙම ඊනියා බාහික ක්ෂුද්‍ර නල සෙලියුලෝස් සින්තේස් සංකීර්ණ නියාමනය කිරීම හරහා සෙලියුලෝස් ක්ෂුද්‍ර තන්තු සංවිධානය පාලනය කරන බව සැලකේ4,5. මූල තුඩ වේගයෙන් දිගු වන කලාපයේ පවතින මූල එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්‍ර නල පාර්ශ්වීයව පිහිටා ඇති අතර, සෙලියුලෝස් ක්ෂුද්‍ර නල මෙම ක්ෂුද්‍ර නල අනුගමනය කර සෛල ප්‍රසාරණයේ දිශාව සීමා කරයි, එමඟින් ඇනිසොට්‍රොපික් සෛල දිගු කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරයි. එබැවින්, ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය ශාක රූප විද්‍යාවට සමීපව සම්බන්ධ වේ. ටියුබියුලින් කේතනය කරන ජානවල ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශන මගින් බාහික ක්ෂුද්‍ර නල අරා වල ඇලවීම සහ අරාබිඩොප්සිස් 6,7 හි වම් හෝ දකුණු පැත්තේ වර්ධනය ඇති කරයි. ඒ හා සමානව, ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකත්වය නියාමනය කරන ක්ෂුද්‍ර නල ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන වල විකෘති ද විකෘති මූල වර්ධනයට හේතු විය හැක8,9,10,11,12,13. ඊට අමතරව, ප්‍රෙටිලාක්ලෝර් ලෙසද හැඳින්වෙන ඩිසොපිරමයිඩ් වැනි ක්ෂුද්‍ර නල-බාධා කරන වල්නාශක සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීම ද වම් පැත්තේ ආනත මූල වර්ධනයට හේතු වේ14. මෙම දත්ත වලින් පෙනී යන්නේ ශාක වර්ධනයේ දිශාව තීරණය කිරීම සඳහා ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වයේ නිරවද්‍ය නියාමනය ඉතා වැදගත් බවයි.
විවිධ වර්ගයේ ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධක සොයාගෙන ඇති අතර, මෙම ඖෂධ සයිටොස්කෙලිටල් පර්යේෂණ සඳහා මෙන්ම කෘෂිකර්මාන්තය සහ වෛද්‍ය විද්‍යාව සඳහා සැලකිය යුතු දායකත්වයක් ලබා දී ඇත. විශේෂයෙන්, ඔරිසාලින්, ඩයිනිට්‍රොඇනිලීන් සංයෝග, ඩිසොපිරමයිඩ්, බෙන්සාමයිඩ් ආශ්‍රිත සංයෝග සහ ඒවායේ ප්‍රතිසමයන් ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වන අතර එමඟින් ශාක වර්ධනය වළක්වයි. එබැවින්, ඒවා වල් නාශක ලෙස බහුලව භාවිතා වේ. කෙසේ වෙතත්, ක්ෂුද්‍ර නල ශාක හා සත්ව සෛලවල වැදගත් සංරචකයක් වන බැවින්, බොහෝ ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධක සෛල වර්ග දෙකටම සයිටොටොක්සික් වේ. එබැවින්, වල් නාශක ලෙස ඒවායේ පිළිගත් උපයෝගීතාව තිබියදීත්, ප්‍රායෝගික අරමුණු සඳහා සීමිත සංඛ්‍යාවක ප්‍රති-ක්ෂුද්‍ර නල කාරක භාවිතා කරනු ලැබේ.
Streptomyces යනු Streptomyces පවුලේ කුලයක් වන අතර එයට aerobic, gram-positive, සූතිකාමය බැක්ටීරියා ඇතුළත් වන අතර පුළුල් පරාසයක ද්විතියික පරිවෘත්තීය ද්‍රව්‍ය නිපදවීමේ හැකියාව සඳහා පුළුල් ලෙස ප්‍රසිද්ධය. එබැවින්, එය නව ජීව විද්‍යාත්මකව ක්‍රියාකාරී ස්වාභාවික නිෂ්පාදනවල වැදගත්ම ප්‍රභවයක් ලෙස සැලකේ. වත්මන් අධ්‍යයනයේ දී, අපි Streptomyces werraensis MK493-CF1 සහ S. werraensis ISP 5486 වලින් හුදකලා කරන ලද coumamonamide නම් නව සංයෝගයක් සොයා ගත්තෙමු. වර්ණාවලි විශ්ලේෂණය සහ සම්පූර්ණ වර්ණාවලි විශ්ලේෂණය භාවිතා කරමින්, coumamonamide ව්‍යුහය සංලක්ෂිත කරන ලද අතර එහි අද්විතීය N-alkoxypyrrole ඇටසැකිල්ල තීරණය කරන ලදී. සංස්ලේෂණය. ursmonoamide සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන්ගේ කෘතිම අතරමැදියක් වන Ursmonic අම්ලය, ජනප්‍රිය ආදර්ශ ශාකයක් වන Arabidopsis thaliana හි වර්ධනය හා ප්‍රරෝහණය වළක්වන බව සොයා ගන්නා ලදී. ව්‍යුහ-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතා අධ්‍යයනයකදී, ursonic අම්ලයට වෙනස් කරන ලද C9 සහිත සංයෝගයක්, ursonic අම්ලයේ (KAND) nonyloxy ව්‍යුත්පන්නය ලෙස හැඳින්වෙන අතර, වර්ධනය හා ප්‍රරෝහණය කෙරෙහි නිෂේධනීය බලපෑම සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි දියුණු කරන බව අපට පෙනී ගියේය. විශේෂයෙන්, අලුතින් සොයාගත් ශාක වර්ධන නිෂේධකය දුම්කොළ සහ අක්මා වර්ට් වල වර්ධනයට ද බලපෑ අතර බැක්ටීරියා හෝ HeLa සෛල වලට සයිටොටොක්සික් නොවීය. එපමණක් නොව, සමහර උර්මොටොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් විකෘති වූ මූල ප්‍රවේණිකයක් ඇති කරයි, එයින් ඇඟවෙන්නේ මෙම ව්‍යුත්පන්නයන් ක්ෂුද්‍ර නල වලට සෘජුව හෝ වක්‍රව බලපාන බවයි. මෙම අදහසට අනුකූලව, ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායනිකව හෝ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන සමඟ ලේබල් කර ඇති ක්ෂුද්‍ර නල පිළිබඳ අපගේ නිරීක්ෂණවලින් පෙනී යන්නේ KAND ප්‍රතිකාරය ක්ෂුද්‍ර නල විපොලිමරීකරණය කරන බවයි. ඊට අමතරව, කුමාමොටොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් ඇක්ටින් ක්ෂුද්‍ර සූත්‍රිකාවන් කඩාකප්පල් විය. මේ අනුව, අපි නව ශාක වර්ධන නිෂේධකයක් සොයාගෙන ඇති අතර එහි අද්විතීය ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණය සයිටොස්කෙලිටන් විනාශ කිරීමයි.
ටෝකියෝවේ ෂිනගාවා-කු හි පසෙන් MK493-CF1 වික්‍රියාව හුදකලා කරන ලදී. වික්‍රියාව MK493-CF1 හොඳින් අතු බෙදී ගිය ස්ට්‍රෝමල් මයිසිලියම් සෑදී ඇත. 16S රයිබසෝම RNA ජානයේ (1422 bp) අර්ධ අනුපිළිවෙල තීරණය කරන ලදී. මෙම වික්‍රියාව S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: සාමාන්‍ය වික්‍රියාව, 99.93%) ට බෙහෙවින් සමාන ය. මෙම ප්‍රතිඵලය මත පදනම්ව, මෙම වික්‍රියාව S. werraensis වර්ගයේ වික්‍රියාවට සමීපව සම්බන්ධ බව තීරණය කරන ලදී. එබැවින්, අපි මෙම වික්‍රියාව තාවකාලිකව S. werraensis MK493-CF1 ලෙස නම් කළෙමු. S. werraensis ISP 5486T ද එම ජෛව ක්‍රියාකාරී සංයෝග නිපදවයි. මෙම ක්ෂුද්‍ර ජීවියාගෙන් ස්වාභාවික නිෂ්පාදන ලබා ගැනීම පිළිබඳ මුල් කාලීන පර්යේෂණ ඉතා අල්ප බැවින්, තවදුරටත් රසායනික පර්යේෂණ සිදු කරන ලදී. දින 14ක් ඝන-තත්ව පැසවීම මගින් 30°C දී බාර්ලි මාධ්‍යයේ S. werraensis MK493-CF1 වගා කිරීමෙන් පසු, මාධ්‍යය 50% EtOH සමඟ නිස්සාරණය කරන ලදී. නියැදියෙන් මිලි ලීටර් 60ක් වියළා, අමු සාරය 59.5 mg ලබා ගන්නා ලදී. අමු සාරය N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide ලෙස නම් කර ඇත, 36.0 mg) ලබා දීම සඳහා ප්‍රතිලෝම අදියර HPLC වලට භාජනය කරන ලදී. 1 හි මුළු ප්‍රමාණය අමු සාරයෙන් ආසන්න වශයෙන් 60% කි. එබැවින්, කුමාමොටොමයිඩ් 1 හි ගුණාංග විස්තරාත්මකව අධ්‍යයනය කිරීමට අපි තීරණය කළෙමු.
කූමමොනමයිඩ් 1 යනු සුදු පැහැති අස්ඵටික කුඩු වර්ගයක් වන අතර ඉහළ විභේදන ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (HRESIMS) C6H8N2O2 තහවුරු කරයි (රූපය 1). මෙම සංයෝගයේ C2-ආදේශක පයිරෝල් කොටස δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, 1H NMR වර්ණාවලියේ δH: 4.5 Hz, H-5) සහ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) මගින් සංලක්ෂිත වන අතර 13C NMR වර්ණාවලිය sp2 කාබන් පරමාණු හතරක් පවතින බව පෙන්වයි. C2 ස්ථානයේ ඇමයිඩ් කාණ්ඩයක පැවැත්ම δC 161.1 හි C-3 ප්‍රෝටෝනයේ සිට ඇමයිඩ් කාබොනයිල් කාබන් දක්වා HMBC සහසම්බන්ධය මගින් තක්සේරු කරන ලදී. ඊට අමතරව, δH 4.10 (3H, S) සහ δC 68.3 හි 1 H සහ 13 C NMR උපරිම අගයන් අණුවේ N-මෙතොක්සි කාණ්ඩ පවතින බව පෙන්නුම් කරයි. වැඩි දියුණු කළ වෙනස වර්ණාවලීක්ෂය සහ න්‍යෂ්ටික ඕවර්හවුසර් කෙටි යෙදුම (NOEDF) වැනි වර්ණාවලීක්ෂ විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් මෙතොක්සි කාණ්ඩයේ නිවැරදි පිහිටීම තවමත් තීරණය කර නොතිබුණද, N-මෙතොක්සි-1H-පයිරෝල්-2-කාබොක්සැමයිඩ් පළමු අපේක්ෂක සංයෝගය බවට පත්විය.
1 හි නිවැරදි ව්‍යුහය තීරණය කිරීම සඳහා, සම්පූර්ණ සංස්ලේෂණයක් සිදු කරන ලදී (රූපය 2a). වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි 2-ඇමයිනොපිරිඩීන් 2 m-CPBA සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් ප්‍රමාණාත්මක අස්වැන්නක් සඳහා අනුරූප N-ඔක්සයිඩ් 3 ලැබුණි. 2 හි 2-ඇමයිනොසයිඩකරණයෙන් පසුව, ඒබ්‍රමොවිච් විසින් විස්තර කරන ලද සයික්ලොකන්ඩෙන්සේෂන් ප්‍රතික්‍රියාව 90°C දී බෙන්සීන් හි සිදු කරන ලද අතර එමඟින් අපේක්ෂිත 1-හයිඩ්‍රොක්සි-1H-පයිරෝල්-2-කාබොනිට්‍රයිල් 5 ග්‍රෑම් වලින් ලබා ගන්නා ලදී. වේගය 60% (අදියර දෙකක්). 15,16. 4 හි මෙතිලීකරණය සහ ජල විච්ඡේදනය පසුව හොඳ අස්වැන්නක් (70%, පියවර දෙකක්) තුළ 1-මෙතොක්සි-1H-පයිරෝල්-2-කාබොක්සිලික් අම්ලය ("කුමොටොනික් අම්ලය" ලෙස හැඳින්වේ, 6) ලබා දුන්නේය. අවසාන වශයෙන්, ජලීය ඇමෝනියා භාවිතා කරමින් අම්ල ක්ලෝරයිඩ් අතරමැදි 6 හරහා ඇමයිඩකරණය කුමාමොටෝ ඇමයිඩ් 98% අස්වැන්නක් සඳහා 1 ලබා දුන්නේය. සංස්ලේෂණය කරන ලද 1 හි සියලුම වර්ණාවලි දත්ත හුදකලා 1 ට සමාන වූ බැවින් 1 හි ව්‍යුහය තීරණය කරන ලදී;
උර්බෙනාමයිඩ් සහ උර්බෙනික් අම්ලයේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ සාමාන්‍ය සංස්ලේෂණය සහ විශ්ලේෂණය. (අ) කුමාමොටෝ ඇමයිඩ් සම්පූර්ණ සංස්ලේෂණය. (ආ) දින හතක් වයසැති වල් වර්ගයේ අරාබිඩොප්සිස් කොලොම්බියා (කොල්) බීජ පැල මුරෂිගේ සහ ස්කූග් (එම්එස්) තහඩු මත කූමමොනමයිඩ් 6 හෝ කූමමොනමයිඩ් 1 අඩංගු වන පරිදි දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන්හිදී වගා කරන ලදී. පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී.
පළමුව, අපි උර්බෙනාමයිඩ් සහ එහි අතරමැදි වල ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් තක්සේරු කළේ ශාක වර්ධනය මොඩියුලේට් කිරීමේ හැකියාව සඳහා ය. අපි මෙම මාධ්‍යයේ MS agar මාධ්‍යයට සහ වගා කරන ලද අරාබිඩොප්සිස් තාලියානා බීජ පැලවලට උර්ස්මොනමයිඩ් 1 හෝ උර්ස්මොනික් අම්ලය 6 හි විවිධ සාන්ද්‍රණයන් එකතු කළෙමු. මෙම පරීක්ෂණවලින් පෙන්නුම් කළේ 6 හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් (500 μM) මූල වර්ධනය වළක්වන බවයි (රූපය 2b). ඊළඟට, අපි 6 හි N1 ස්ථානය ආදේශ කිරීමෙන් විවිධ ව්‍යුත්පන්නයන් ජනනය කළ අතර ඒවා මත ව්‍යුහ-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතා අධ්‍යයනයන් සිදු කළෙමු (ඇනලොග් සංස්ලේෂණ ක්‍රියාවලිය සහායක තොරතුරු (SI) හි විස්තර කර ඇත). අරාබිඩොප්සිස් බීජ පැල 50 μM උර්සොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්න අඩංගු මාධ්‍යයක් මත වගා කරන ලද අතර මූල දිග මනිනු ලැබීය. එය පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි. රූප 3a, b සහ S1 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, කූමාමෝ අම්ලවලට N1 ස්ථානයේ විවිධ දිග රේඛීය ඇල්කොක්සි දාම (9, 10, 11, 12, සහ 13) හෝ විශාල ඇල්කොක්සි දාම (15, 16, සහ 17) ඇත. ව්‍යුත්පන්නයන් මූල වර්ධනය සැලකිය යුතු ලෙස නිෂේධනය කරන බව පෙන්නුම් කළේය. ඊට අමතරව, 200 μM 10, 11, හෝ 17 යෙදීමෙන් ප්‍රරෝහණය වළක්වන බව අපට පෙනී ගියේය (රූප 3c සහ S2).
කුමාමොටෝ ඇමයිඩ් සහ ඒ ආශ්‍රිත සංයෝගවල ව්‍යුහය-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතාවය අධ්‍යයනය කිරීම. (අ) ප්‍රතිසමවල ව්‍යුහය සහ සංස්ලේෂණ යෝජනා ක්‍රමය. (ආ) 50 μM කූමමොනමයිඩ් ව්‍යුත්පන්නයන් සමඟ හෝ නැතිව MS මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද දින 7 ක් වයසැති බීජ පැලවල මුල් දිග ප්‍රමාණනය කිරීම. තරු ලකුණු ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t පරීක්ෂණය, p< 0.05). n>18. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD ලෙස දක්වා ඇත. nt යන්නෙන් අදහස් කරන්නේ බීජ වලින් 50% කට වඩා ප්‍රරෝහණය නොවූ නිසා “පරීක්ෂා නොකළ” යන්නයි. (ඇ) 200 μM කූමමොනමයිඩ් සහ ඒ ආශ්‍රිත සංයෝග සමඟ හෝ නැතිව MS මාධ්‍යයේ දින 7 ක් පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලද ප්‍රතිකාර කළ බීජවල ප්‍රරෝහණ අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම. තරු ලකුණු ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (චි-චතුරස්‍ර පරීක්ෂණය). n=96.
සිත්ගන්නා කරුණ නම්, C9 ට වඩා දිගු ඇල්කයිල් පැති දාම එකතු කිරීම නිෂේධනීය ක්‍රියාකාරිත්වය අඩු කළ අතර, කුමාමොටොයික් අම්ලය ආශ්‍රිත සංයෝගවලට ඒවායේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රදර්ශනය කිරීම සඳහා නිශ්චිත ප්‍රමාණයේ පැති දාම අවශ්‍ය බව යෝජනා කිරීමයි.
ව්‍යුහ-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතා විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ C9 උර්සොනික් අම්ලය බවට වෙනස් කර ඇති බවත්, උර්සොනික් අම්ලයේ නොනිලොක්සි ව්‍යුත්පන්නය (මින් ඉදිරියට KAND 11 ලෙස හැඳින්වේ) වඩාත් ඵලදායී ශාක වර්ධන නිෂේධකය බවත්, අපි KAND 11 පිළිබඳ වඩාත් සවිස්තරාත්මක ලක්ෂණයක් සිදු කළෙමු. 50 μM KAND 11 සමඟ අරාබිඩොප්සිස් ප්‍රතිකාර කිරීම ප්‍රරෝහණය සම්පූර්ණයෙන්ම පාහේ වැළැක්වූ අතර, KAND 11 හි අඩු සාන්ද්‍රණයන් (40, 30, 20, හෝ 10 μM) මාත්‍රාව මත රඳා පවතින ආකාරයෙන් මූල වර්ධනය වළක්වන ලදී (රූපය 4a, b). KAND 11 මූල මෙරිස්ටම් ශක්‍යතාවයට බලපාන්නේද යන්න පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි ප්‍රොපිඩියම් අයඩයිඩ් (PI) සමඟ පැල්ලම් කරන ලද මූල මෙරිස්ටම් පරීක්ෂා කර මෙරිස්ටම් ප්‍රදේශ ප්‍රමාණය මනින ලදී. 25 μM KAND-11 අඩංගු මාධ්‍යයක වගා කරන ලද බීජ පැලවල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය 151.1 ± 32.5 μm වූ අතර, DMSO අඩංගු පාලන මාධ්‍යයක වගා කරන ලද බීජ පැලවල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය 264.7 ± 30.8 μm (රූපය 4c, d) වූ අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ KAND-11 සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් යථා තත්ත්වයට පත් කරන බවයි. පැතිරීම. මූල මෙරිස්ටම්. මෙයට අනුකූලව, KAND 11 ප්‍රතිකාරය මූල මෙරිස්ටම් හි සෛල බෙදීම් සලකුණ CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS සංඥා ප්‍රමාණය අඩු කළේය (රූපය 4e) 17. මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ KAND 11 සෛල ප්‍රගුණන ක්‍රියාකාරිත්වය අඩු කිරීමෙන් මූල වර්ධනය වළක්වන බවයි.
උර්බෙනොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් (උර්බෙනිලොක්සි ව්‍යුත්පන්නයන්) වර්ධනයට ඇති කරන නිෂේධනීය බලපෑම විශ්ලේෂණය කිරීම. (අ) KAND 11 හි දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන් සහිත MS තහඩු මත වගා කරන ලද දින 7 ක් වයසැති වල් වර්ගයේ කොල් බීජ පැල. පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී. (ආ) මූල දිග ප්‍රමාණනය කිරීම. අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (ටුකී HSD පරීක්ෂණය, p< 0.05). n>16. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD ලෙස දක්වා ඇත. (c) 25 μM KAND සහිත හෝ රහිතව MS තහඩු මත වගා කරන ලද ප්‍රොපිඩියම් අයඩයිඩ්-පැල්ලම් සහිත වල්-වර්ගයේ කෝල් මුල්වල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය 11. සුදු වරහන් මඟින් මූල මෙරිස්ටම් දක්වයි. පරිමාණ තීරුව = 100 µm. (d) මූල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණයේ ප්‍රමාණනය (n = 10 සිට 11 දක්වා). සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් t-පරීක්ෂණය භාවිතයෙන් තීරණය කරන ලදී (p< 0.05). තීරු සාමාන්‍ය මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය නියෝජනය කරයි. (e) CDKB2 නිර්මාණය අඩංගු මූල මෙරිස්ටම් එකක අවකල මැදිහත්වීමේ ප්‍රතිවිරුද්ධතාව (DIC) අන්වීක්ෂය; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND පරීක්ෂණයක් සහිතව හෝ රහිතව MS තහඩු මත වගා කරන ලද දින 5 ක් වයසැති බීජ පැල මත 1-GUS පැල්ලම් කර පැල්ලම් කර ඇත.
KAND 11 හි ශාක විෂ වීම තවත් ද්විකෝටිලඩෝනස් ශාකයක් වන දුම්කොළ (නිකොටියානා ටැබකම්) සහ ප්‍රධාන භූමි ශාක ආකෘති ජීවියෙකු වන ලිවර්වෝර්ට් (මාර්චන්ටියා පොලිමෝර්ෆා) භාවිතයෙන් තවදුරටත් පරීක්ෂා කරන ලදී. අරාබිඩොප්සිස් හි මෙන්, 25 μM KAND 11 අඩංගු මාධ්‍යයක වගා කරන ලද දුම්කොළ SR-1 බීජ පැල කෙටි මුල් නිපදවීය (රූපය 5a). ඊට අමතරව, බීජ 48 න් 40 ක් 200 μM KAND 11 අඩංගු තහඩු මත ප්‍රරෝහණය වූ අතර, සියලුම බීජ 48 ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර කළ මාධ්‍ය මත ප්‍රරෝහණය වූ අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ KAND හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් සැලකිය යුතු බවයි (p< 0.05; chi test -square) දුම්කොළ ප්‍රරෝහණය වීම වළක්වයි. (රූපය 5b). ඊට අමතරව, අක්මා වර්ට් වල බැක්ටීරියා වර්ධනය වළක්වන KAND 11 සාන්ද්‍රණය Arabidopsis හි ඵලදායී සාන්ද්‍රණයට සමාන විය (රූපය 5c). මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ KAND 11 විවිධ ශාකවල වර්ධනය වළක්වන බවයි. ඉන්පසු අපි අනෙකුත් ජීවීන් තුළ, එනම් මානව HeLa සෛල සහ Escherichia coli strain DH5α හි වලස් මොනොඇමයිඩ් ආශ්‍රිත සංයෝගවල ඇති විය හැකි සයිටොටොක්සිසිටි බව පිළිවෙලින් ඉහළ සත්ව සහ බැක්ටීරියා සෛලවල නියෝජිතයන් ලෙස විමර්ශනය කළෙමු. සෛල ප්‍රගුණන පරීක්ෂණ මාලාවකදී, කූමමොනමයිඩ් 1, කූමමොනමිඩික් අම්ලය 6 සහ KAND 11 100 μM සාන්ද්‍රණයකදී HeLa හෝ E. coli සෛල වර්ධනයට බල නොපාන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (රූපය 5d,e).
අරාබිඩොප්සිස් නොවන ජීවීන් තුළ KAND 11 වර්ධනය වැළැක්වීම. (අ) සති දෙකක් වයසැති වල් වර්ගයේ SR-1 දුම්කොළ බීජ පැල 25 μM KAND 11 අඩංගු සිරස් අතට ස්ථානගත කර ඇති MS තහඩු මත වගා කරන ලදී. (ආ) සති දෙකක් වයසැති වල් වර්ගයේ SR-1 දුම්කොළ බීජ පැල 200 μM KAND 11 අඩංගු තිරස් අතට ස්ථානගත කර ඇති MS තහඩු මත වගා කරන ලදී. (ඇ) KAND 11 හි දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන් සහිත ගැම්බෝර්ග් B5 තහඩු මත වගා කරන ලද සති දෙකක් වයසැති වල් වර්ගයේ Tak-1 ලිවර්වෝර්ට් අංකුර. රතු ඊතල මඟින් සති දෙකක පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කාලය තුළ වර්ධනය නතර වූ බීජාණු දක්වයි. (ඈ) HeLa සෛලවල සෛල ප්‍රගුණන පරීක්ෂණය. සෛල ගණන් කිරීමේ කට්ටලයක් 8 (ඩොජින්ඩෝ) භාවිතයෙන් ස්ථාවර කාල පරතරයන්හිදී ශක්‍ය සෛල ගණන මනිනු ලැබීය. පාලනයක් ලෙස, HeLa සෛල 5 μg/ml ඇක්ටිනොමයිසින් D (Act D) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර එය RNA පොලිමරේස් පිටපත් කිරීම වළක්වන අතර සෛල මරණයට හේතු වේ. විශ්ලේෂණයන් ත්‍රිත්ව වශයෙන් සිදු කරන ලදී. (ඉ) E. coli සෛල ප්‍රගුණන පරීක්ෂණය. E. coli වර්ධනය OD600 මැනීම මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. පාලනයක් ලෙස, සෛල වලට 50 μg/ml ඇම්පිසිලින් (Amp) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර එය බැක්ටීරියා සෛල බිත්ති සංස්ලේෂණය වළක්වයි. විශ්ලේෂණයන් ත්‍රිත්ව වශයෙන් සිදු කරන ලදී.
යුරමයිඩ් ආශ්‍රිත සංයෝග නිසා ඇතිවන සයිටොටොක්සිසිටි ක්‍රියාකාරිත්වයේ යාන්ත්‍රණය තේරුම් ගැනීම සඳහා, අපි මධ්‍යස්ථ නිෂේධනීය බලපෑම් සහිත උර්බෙනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්න නැවත විශ්ලේෂණය කළෙමු. එය පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි. රූප සටහන් 2b, 6a හි පෙන්වා ඇති පරිදි, උර්මොටොනික් අම්ලය 6 හි ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් (200 μM) අඩංගු ඒගාර් තහඩු මත වගා කරන ලද බීජ පැල කෙටි සහ වම්-වක්‍ර මුල් (θ = – 23.7 ± 6.1) නිපදවූ අතර, පාලන මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද බීජ පැලවල, බීජ පැල පාහේ සෘජු මුල් (θ = – 3.8 ± 7.1) නිපදවීය. මෙම ලාක්ෂණික ආනත වර්ධනය බාහික ක්ෂුද්‍ර නල වල අක්‍රියතාවයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස දන්නා කරුණකි14,18. මෙම සොයා ගැනීමට අනුකූලව, ක්ෂුද්‍ර නල-අස්ථාවර කරන ඖෂධ ඩිසොපිරමයිඩ් සහ ඔරිසාලින් අපගේ වර්ධන තත්වයන් යටතේ සමාන මූල ඇලවීමක් ඇති කළේය (රූප 2b, 6a). ඒ සමඟම, අපි උර්මොටොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් පරීක්ෂා කළ අතර, ඇතැම් සාන්ද්‍රණයන්හිදී, ආනත මූල වර්ධනයට හේතු වූ ඒවායින් කිහිපයක් තෝරා ගත්තෙමු. 8, 9 සහ 15 සංයෝග පිළිවෙලින් 75 μM, 50 μM සහ 40 μM හි මුල් වර්ධනයේ දිශාව වෙනස් කළ අතර, මෙම සංයෝග ක්ෂුද්‍ර නල ඵලදායී ලෙස අස්ථාවර කළ හැකි බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 2b, 6a). අපි වඩාත් ප්‍රබල උර්සොලික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නය වන KAND 11 අඩු සාන්ද්‍රණයකින් (15 µM) පරීක්ෂා කළ අතර KAND 11 යෙදීම මූල වර්ධනය වළක්වන බවත් මූල වර්ධනයේ දිශාව අසමාන බවත් සොයා ගත්තෙමු, නමුත් ඒවා වමට බෑවුමට නැඹුරු විය (රූපය C3). ක්ෂුද්‍ර නල-අස්ථාවර ඖෂධවල ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් සමහර විට මූල ඇලවීමට හේතු නොවී ශාක වර්ධනය වළක්වන බැවින්, පසුව අපි KAND 11 මූල එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්‍ර නල නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් ක්ෂුද්‍ර නල වලට බලපාන බවට ඇති හැකියාව තක්සේරු කළෙමු. 25 μM KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද බීජ පැළ මුල්වල එපීඩර්මල් සෛලවල ප්‍රති-β-ටියුබුලින් ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරන ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායන විද්‍යාව මගින් දිගු කිරීමේ කලාපයේ එපීඩර්මල් සෛලවල ඇති සියලුම බාහික ක්ෂුද්‍ර නල පාහේ අතුරුදහන් වී ඇති බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 6b). මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ කුමාමොටොනික් අම්ලය සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන් ක්ෂුද්‍ර නල මත සෘජුව හෝ වක්‍රව ක්‍රියා කර ඒවා කඩාකප්පල් කරන බවත් මෙම සංයෝග නව ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධක බවත්ය.
උර්සොනික් අම්ලය සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන් අරාබිඩොප්සිස් තාලියානා හි බාහික ක්ෂුද්‍ර නල වෙනස් කරයි. (අ) දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන්හිදී විවිධ උර්මොටොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් ඉදිරියේ මූල නැඹුරු කෝණය මනිනු ලැබේ. ක්ෂුද්‍ර නල වලක්වන බව දන්නා සංයෝග දෙකක බලපෑම්: ඩිසොපිරමයිඩ් සහ ඔරිසාලින් ද විශ්ලේෂණය කරන ලදී. මූල වර්ධන කෝණය මැනීමට භාවිතා කරන ප්‍රමිතිය ඇතුළත් කර ඇත. තරු ලකුණු ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t පරීක්ෂණය, p< 0.05). n>19. පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී. (ආ) දිගු කලාපයේ එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්‍ර නල. 25 μM KAND 11 සහිත හෝ රහිත MS තහඩු මත වගා කරන ලද වල්-වර්ගයේ Arabidopsis Col මුල්වල ක්ෂුද්‍ර නල, β-ටියුබුලින් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ සහ ඇලෙක්සා ෆ්ලෝර්-සංයුක්ත ද්විතියික ප්‍රතිදේහ භාවිතයෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ හිස්ටෝරමිකල් පැල්ලම් කිරීම මගින් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. පරිමාණ තීරුව = 10 µm. (ඇ) මූල මෙරිස්ටම් හි ක්ෂුද්‍ර නල වල මයිටොටික් ව්‍යුහය. ප්‍රතිශක්ති හිස්ටෝරමිකල් පැල්ලම් කිරීම භාවිතයෙන් ක්ෂුද්‍ර නල දෘශ්‍යමාන කරන ලදී. ප්‍රොපේස් කලාප, ස්පින්ඩල් සහ ෆ්‍රැග්මොප්ලාස්ට් ඇතුළු මයිටොටික් ව්‍යුහයන්, කොන්ෆෝකල් රූප වලින් ගණනය කරන ලදී. ඊතල මගින් මයිටොටික් ක්ෂුද්‍ර නල ව්‍යුහයන් දක්වයි. තරු ලකුණු ව්‍යාජ ප්‍රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t පරීක්ෂණය, p< 0.05). n>9. පරිමාණ තීරුව = 50 µm.
උර්සා වලට ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය කඩාකප්පල් කිරීමේ හැකියාව තිබුණද, එහි ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණය සාමාන්‍ය ක්ෂුද්‍ර නල ඩිපොලිමරයිසින් කාරකවලට වඩා වෙනස් වනු ඇතැයි අපේක්ෂා කෙරේ. නිදසුනක් ලෙස, ඩිසොපිරමයිඩ් සහ ඔරිසාලින් වැනි ක්ෂුද්‍ර නල ඩිපොලිමරයිසින් කාරකවල ඉහළ සාන්ද්‍රණයන් එපීඩර්මල් සෛලවල ඇනිසොට්‍රොපික් ප්‍රසාරණය ඇති කරන අතර KAND 11 එසේ නොකරයි. ඊට අමතරව, KAND 11 සහ ඩිසොපිරමයිඩ් සම-යෙදීමේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස ඒකාබද්ධ ඩිසොපිරමයිඩ්-ප්‍රේරිත මූල වර්ධන ප්‍රතිචාරයක් ඇති වූ අතර KAND 11-ප්‍රේරිත වර්ධන නිෂේධනයක් නිරීක්ෂණය විය (රූපය S4). KAND 11 ට විකෘති වූ අධි සංවේදී ඩිසොපිරමයිඩ් 1-1 (phs1-1) හි ප්‍රතිචාරය ද අපි විශ්ලේෂණය කළෙමු. phs1-1 හි කැනොනිකල් නොවන ටියුබුලින් කයිනාස් ලක්ෂ්‍ය විකෘතියක් ඇති අතර ඩිසොපිරමයිඩ් සමඟ ප්‍රතිකාර කළ විට කෙටි මුල් නිපදවයි9,20. KAND 11 අඩංගු ඒගාර් මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද phs1-1 විකෘති බීජ පැලවල ඩිසොපිරමයිඩ් මත වගා කරන ලද ඒවාට සමාන කෙටි මුල් තිබුණි (රූපය S5).
ඊට අමතරව, KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද බීජ පැලවල මූල මෙරිස්ටම් තුළ, ප්‍රොපේස් කලාප, ස්පින්ඩල් සහ ෆ්‍රැග්මොප්ලාස්ට් වැනි මයිටොටික් ක්ෂුද්‍ර නල ව්‍යුහයන් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS සඳහා වූ නිරීක්ෂණවලට අනුකූලව, මයිටොටික් ක්ෂුද්‍ර නල සංඛ්‍යාවේ සැලකිය යුතු අඩුවීමක් නිරීක්ෂණය විය (රූපය .6c).
උප සෛලීය විභේදනයේදී KAND 11 හි සයිටොටොක්සිසිටි බව සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි දුම්කොළ BY-2 අත්හිටුවීමේ සෛල KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කර ඒවායේ ප්‍රතිචාරය නිරීක්ෂණය කළෙමු. අපි මුලින්ම KAND 11, ක්ෂුද්‍ර නල මත KAND 11 හි බලපෑම තක්සේරු කිරීම සඳහා ප්‍රතිදීප්ත ලෙස ක්ෂුද්‍ර නල ලේබල් කරන TagRFP-TUA6 ප්‍රකාශ කරන BY-2 සෛල වලට එකතු කළෙමු. රූප විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් බාහික ක්ෂුද්‍ර නල ඝනත්වය තක්සේරු කරන ලද අතර, එය සයිටොප්ලාස්මික් පික්සල අතර සයිටොස්කෙලිටල් පික්සලවල ප්‍රතිශතය ප්‍රමාණනය කළේය. පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී ගියේ පැය 1 ක් සඳහා 50 μM හෝ 100 μM KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු ඝනත්වය පිළිවෙලින් 0.94 ± 0.74% හෝ 0.23 ± 0.28% දක්වා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වූ අතර, DMSO සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද සෛලවල ඝනත්වය 1.61 ± 0.34% ක් විය (රූපය 7a). මෙම ප්‍රතිඵල Arabidopsis හි නිරීක්ෂණයට අනුකූල වන අතර KAND 11 ප්‍රතිකාරය මගින් බාහික ක්ෂුද්‍ර නල වල විපොලිමරීකරණය ඇති කරයි (රූපය 6b). KAND 11 හි එකම සාන්ද්‍රණයකින් ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් පසු GFP-ABD-ලේබල් කරන ලද ඇක්ටින් සූතිකා සමඟ BY-2 රේඛාව ද අපි පරීක්ෂා කළ අතර KAND 11 ප්‍රතිකාරය ඇක්ටින් සූතිකා වලට බාධා කරන බව නිරීක්ෂණය කළෙමු. පැය 1 ක් සඳහා 50 μM හෝ 100 μM KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් ඇක්ටින් සූතිකා ඝනත්වය පිළිවෙලින් 1.20 ± 0.62% හෝ 0.61 ± 0.26% දක්වා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වූ අතර, DMSO-ප්‍රතිකාර කළ සෛලවල ඝනත්වය 1.69 ± 0.51% විය (රූපය 2). 7b). මෙම ප්‍රතිඵල ඇක්ටින් සූතිකා වලට බලපාන්නේ නැති ප්‍රොපිසාමයිඩ් සහ ක්ෂුද්‍ර නල වලට බලපාන්නේ නැති ඇක්ටින් ඩිපොලිමරයිසර් එකක් වන ලැට්‍රන්කුලින් B හි බලපෑම් සමඟ වෙනස් වේ (SI රූපය S6). ඊට අමතරව, කූමමොනමයිඩ් 1, කූමමොනමයිඩ් අම්ලය 6, හෝ KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් HeLa සෛලවල ක්ෂුද්‍ර නල වලට බලපෑමක් සිදු නොවීය (SI රූපය S7). මේ අනුව, KAND 11 හි ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණය දන්නා සයිටොස්කෙලිටන් කඩාකප්පල් කරන්නන්ට වඩා වෙනස් බව විශ්වාස කෙරේ. ඊට අමතරව, KAND 11 සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල පිළිබඳ අපගේ අන්වීක්ෂීය නිරීක්ෂණ මගින් KAND 11 ප්‍රතිකාරයේදී සෛල මරණයේ ආරම්භය අනාවරණය වූ අතර KAND 11 ප්‍රතිකාරයෙන් මිනිත්තු 30 කට පසු එවන්ස් නිල් පැහැති මළ සෛල අනුපාතය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි නොවූ බව පෙන්නුම් කළ අතර, 50 μM හෝ 100 μM KAND සමඟ ප්‍රතිකාර කිරීමෙන් මිනිත්තු 90 කට පසු, මිය ගිය සෛල සංඛ්‍යාව පිළිවෙලින් 43.7% හෝ 80.1% දක්වා වැඩි විය (රූපය 7c). එකට ගත් කල, මෙම දත්ත වලින් පෙනී යන්නේ නව උර්සොලික් අම්ල ව්‍යුත්පන්න KAND 11 යනු කලින් නොදන්නා ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණයක් සහිත ශාක-විශේෂිත සයිටොස්කෙලිටල් නිෂේධකයක් බවයි.
KAND, බාහික ක්ෂුද්‍ර නල, ඇක්ටින් සූතිකා සහ දුම්කොළ BY-2 සෛලවල ශක්‍යතාවයට බලපායි. (අ) TagRFP-TUA6 ඉදිරියේ BY-2 සෛලවල බාහික ක්ෂුද්‍ර නල දෘශ්‍යකරණය. KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී. බාහික ක්ෂුද්‍ර නල ඝනත්වය ස්වාධීන සෛල 25 ක ක්ෂුද්‍ර රූප වලින් ගණනය කරන ලදී. අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (Tukey HSD පරීක්ෂණය, p< 0.05). පරිමාණ තීරුව = 10 µm. (ආ) GFP-ABD2 ඉදිරියේ දෘශ්‍යමාන කරන ලද BY-2 සෛලවල බාහික ඇක්ටින් සූතිකා. KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී. බාහික ඇක්ටින් සූතිකා වල ඝනත්වය ස්වාධීන සෛල 25 ක ක්ෂුද්‍ර ග්‍රැෆ් වලින් ගණනය කරන ලදී. අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (Tukey HSD පරීක්ෂණය, p< 0.05). පරිමාණ තීරුව = 10 µm. (c) එවන්ස් නිල් පැල්ලම් කිරීම මගින් මිය ගිය BY-2 සෛල නිරීක්ෂණය කිරීම. KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර අන්වීක්ෂය මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී. n=3. පරිමාණ තීරුව = 100 µm.
නව ස්වභාවික නිෂ්පාදන සොයා ගැනීම සහ යෙදීම වෛද්‍ය විද්‍යාව සහ කෘෂිකර්මාන්තය ඇතුළු මිනිස් ජීවිතයේ විවිධ අංශවල සැලකිය යුතු දියුණුවක් ඇති කිරීමට හේතු වී තිබේ. ස්වාභාවික සම්පත් වලින් ප්‍රයෝජනවත් සංයෝග ලබා ගැනීම සඳහා ඓතිහාසික පර්යේෂණ සිදු කර ඇත. විශේෂයෙන්, ඇක්ටිනොමයිසීට් නෙමටෝඩාවන් සඳහා ප්‍රති-පරපෝෂිත ප්‍රතිජීවක ලෙස ප්‍රයෝජනවත් බව දන්නා අතර, ඒවා ඇවර්මෙක්ටින්, අයිවර්මෙක්ටින් සහ බ්ලීයොමයිසින් වල ඊයම් සංයෝගය සහ එහි ව්‍යුත්පන්න වැනි විවිධ ද්විතියික පරිවෘත්තීය නිපදවීමේ හැකියාව නිසා පිළිකා නාශක කාරකයක් ලෙස ඖෂධීය වශයෙන් භාවිතා වේ21,22. ඒ හා සමානව, ඇක්ටිනොමයිසීට් වලින් විවිධ වල්නාශක සංයෝග සොයාගෙන ඇති අතර, ඒවායින් සමහරක් දැනටමත් වාණිජමය වශයෙන් භාවිතා වේ1,23. එබැවින්, අපේක්ෂිත ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් සහිත ස්වාභාවික නිෂ්පාදන හුදකලා කිරීම සඳහා ඇක්ටිනොමයිසීට් පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය ඵලදායී උපාය මාර්ගයක් ලෙස සැලකේ. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි S. werraensis වෙතින් නව සංයෝගයක් වන කූමමොනමයිඩ් සොයා ගත් අතර එය සාර්ථකව සංස්ලේෂණය කළෙමු. උර්සොනික් අම්ලය යනු උර්බෙනාමයිඩ් සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන්ගේ කෘතිම අතරමැදියකි. එය ලාක්ෂණික මූල රැලි වීමට හේතු විය හැක, මධ්‍යස්ථ සිට ශක්තිමත් වල්නාශක ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රදර්ශනය කළ හැකි අතර ශාක ක්ෂුද්‍ර නල වලට සෘජුව හෝ වක්‍රව හානි කළ හැකිය. කෙසේ වෙතත්, උර්මොටොනික් අම්ලයේ ක්‍රියාකාරීත්වයේ යාන්ත්‍රණය පවතින ක්ෂුද්‍ර නල නිෂේධකවලට වඩා වෙනස් විය හැකිය, මන්ද KAND 11 ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කර සෛල මරණයට හේතු වන අතර, උර්මොටොනික් අම්ලය සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන් පුළුල් පරාසයක සයිටොස්කෙලිටල් ව්‍යුහයන්ට බලපෑම් කරන නියාමන යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරයි.
උර්බෙනොනික් අම්ලයේ ක්‍රියාකාරීත්වයේ යාන්ත්‍රණය වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීමට උර්බෙනොනික් අම්ලයේ වැඩිදුර සවිස්තරාත්මක ලක්ෂණ උපකාරී වේ. විශේෂයෙන්, ඊළඟ ඉලක්කය වන්නේ උර්සොනික් අම්ලය සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන් ක්ෂුද්‍ර නල මත සෘජුවම ක්‍රියා කර ඒවා විපොලිමරීකරණය කරන්නේද, නැතහොත් ඒවායේ ක්‍රියාව ක්ෂුද්‍ර නල අස්ථාවර වීමට හේතු වේද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා අඩු කරන ලද ක්ෂුද්‍ර නල වලට බන්ධනය වීමට ඇති හැකියාව ඇගයීමයි. ඊට අමතරව, ක්ෂුද්‍ර නල සෘජු ඉලක්කයක් නොවන අවස්ථාවක, ශාක සෛල මත උර්සොනික් අම්ලයේ ක්‍රියාකාරී ස්ථානය සහ අණුක ඉලක්ක හඳුනා ගැනීම අදාළ සංයෝගවල ගුණාංග සහ වල්නාශක ක්‍රියාකාරකම් වැඩි දියුණු කිරීමට ඇති හැකි ක්‍රම තවදුරටත් තේරුම් ගැනීමට උපකාරී වේ. අපගේ ජෛව ක්‍රියාකාරීත්ව විශ්ලේෂණය මඟින් අරාබිඩොප්සිස් තාලියානා, දුම්කොළ සහ ලිවර්වෝර්ට් වැනි ශාකවල වර්ධනය සඳහා උර්සොනික් අම්ලයේ අද්විතීය සයිටොටොක්සික් හැකියාව හෙළි කළ අතර, E. coli හෝ HeLa සෛල වලට බලපෑමක් සිදු නොවීය. සත්ව සෛල වලට සුළු හෝ විෂ සහිත බවක් නොමැති වීම, විවෘත කෘෂිකාර්මික ක්ෂේත්‍රවල භාවිතය සඳහා වල් නාශක ලෙස සංවර්ධනය කරන්නේ නම්, උර්සොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන්ගේ වාසියකි. ඇත්ත වශයෙන්ම, ක්ෂුද්‍ර නල යුකැරියෝට් වල පොදු ව්‍යුහයන් වන බැවින්, ශාකවල ඒවායේ වරණීය නිෂේධනය වල් නාශක සඳහා ප්‍රධාන අවශ්‍යතාවයකි. නිදසුනක් ලෙස, ටියුබියුලින් සමඟ සෘජුවම බන්ධනය වී බහුඅවයවීකරණය වළක්වන ක්ෂුද්‍ර නල ඩිපොලිමරයිසින් කාරකයක් වන ප්‍රොපිසාමයිඩ්, සත්ව සෛල වලට එහි අඩු විෂ වීම නිසා වල් නාශකයක් ලෙස භාවිතා කරයි24. ඩිසොපිරමයිඩ් වලට වෙනස්ව, අදාළ බෙන්සාමයිඩ් විවිධ ඉලක්ක නිශ්චිතතාවන් ඇත. ශාක ක්ෂුද්‍ර නල වලට අමතරව, RH-4032 හෝ බෙන්සොක්සැමයිඩ් පිළිවෙලින් සත්ව සෛල හෝ ඕමයිසීට් වල ක්ෂුද්‍ර නල ද වළක්වන අතර, එහි අඩු ෆයිටොටොක්සිසිටි බව නිසා සැලිලමයිඩ් දිලීර නාශකයක් ලෙස භාවිතා කරයි25,26,27. අලුතින් සොයාගත් වලසා සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන් ශාක වලට එරෙහිව තෝරාගත් සයිටොටොක්සිසිටි පෙන්නුම් කරයි, නමුත් තවදුරටත් වෙනස් කිරීම් මගින් ඒවායේ ඉලක්ක නිශ්චිතතාව වෙනස් කළ හැකි බව සඳහන් කිරීම වටී, එමඟින් ව්යාධිජනක දිලීර හෝ ඕමයිසීට් පාලනය සඳහා අතිරේක ව්‍යුත්පන්නයන් ලබා දිය හැකිය.
උර්බෙනොනික් අම්ලයේ සහ එහි ව්‍යුත්පන්නයන්ගේ අද්විතීය ගුණාංග වල් නාශක ලෙස සංවර්ධනය කිරීමට සහ පර්යේෂණ මෙවලම් ලෙස භාවිතා කිරීමට ප්‍රයෝජනවත් වේ. ශාක සෛල හැඩය පාලනය කිරීමේදී සයිටොස්කෙලිටනයේ වැදගත්කම පුළුල් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත. මුල් අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ශාක ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකය නිසි ලෙස පාලනය කිරීම සඳහා ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකය පාලනය කිරීමෙන් බාහික ක්ෂුද්‍ර නල සංවිධානයේ සංකීර්ණ යාන්ත්‍රණයන් පරිණාමය කර ඇති බවයි. ක්ෂුද්‍ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කිරීම සඳහා වගකිව යුතු අණු විශාල සංඛ්‍යාවක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, ඒ ආශ්‍රිත පර්යේෂණ තවමත් සිදුවෙමින් පවතී3,4,28. ශාක සෛලවල ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකය පිළිබඳ අපගේ වර්තමාන අවබෝධය බාහික ක්ෂුද්‍ර නල සංවිධානයේ යාන්ත්‍රණයන් සම්පූර්ණයෙන් පැහැදිලි නොකරයි. උදාහරණයක් ලෙස, ඩිසොපිරමයිඩ් සහ ඔරිසාලින් යන දෙකටම ක්ෂුද්‍ර නල විස්ථාපනය කළ හැකි වුවද, ඩිසොපිරමයිඩ් දැඩි මූල විකෘතියක් ඇති කරන අතර ඔරිසාලින් සාපේක්ෂව මෘදු බලපෑමක් ඇති කරයි. එපමණක් නොව, ක්ෂුද්‍ර නල ස්ථාවර කරන ටියුබියුලින් වල විකෘති කිරීම් ද මුල්වල ඩෙක්ස්ට්‍රොරෝටේෂන් ඇති කරන අතර, ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකය ස්ථාවර කරන පැක්ලිටැක්සෙල් එසේ නොකරයි. එබැවින්, උර්සොලික් අම්ලයේ අණුක ඉලක්ක අධ්‍යයනය කිරීම සහ හඳුනා ගැනීම ශාක බාහික ක්ෂුද්‍ර නල නියාමනය පිළිබඳ නව අවබෝධයක් ලබා දිය යුතුය. ඒ හා සමානව, ඩිසොපිරමයිඩ් වැනි විකෘති වර්ධනය ප්‍රවර්ධනය කිරීමේදී ඵලදායී වන රසායනික ද්‍රව්‍ය සහ ඔරිසාලින් හෝ කුමාමෝටෝරික් අම්ලය වැනි අඩු ඵලදායී රසායනික ද්‍රව්‍යවල අනාගත සංසන්දනයන්, විකෘති වර්ධනය සිදුවන ආකාරය පිළිබඳ ඉඟි සපයනු ඇත.
අනෙක් අතට, ආරක්ෂක ආශ්‍රිත සෛල අස්ථි නැවත සකස් කිරීම් උර්සොනික් අම්ලයේ සයිටොටොක්සිසිටි බව පැහැදිලි කිරීමට තවත් හැකියාවකි. රෝග කාරකයක් ආසාදනය වීම හෝ ශාක සෛල තුළට එලිසිටරයක් ​​හඳුන්වා දීම සමහර විට සයිටොස්ටෙලිටන් විනාශ වීමට සහ පසුව සෛල මරණයට හේතු වේ29. උදාහරණයක් ලෙස, ඕමයිසීට්-ව්‍යුත්පන්න ක්‍රිප්ටොක්සැන්ටින් දුම්කොළ සෛල මරණයට පෙර ක්ෂුද්‍ර නල සහ ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කරන බව වාර්තා වී ඇත, KAND ප්‍රතිකාරයේදී සිදුවන දේට සමානව30,31. උර්සොනික් අම්ලය මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර සහ සෛලීය ප්‍රතිචාර අතර සමානකම්, ඒවා පොදු සෛලීය ක්‍රියාවලීන් අවුලුවන බව උපකල්පනය කිරීමට අපට හේතු විය, නමුත් ක්‍රිප්ටොක්සැන්ටින් වලට වඩා උර්සොනික් අම්ලයේ වේගවත් හා ශක්තිමත් බලපෑමක් පැහැදිලිය. කෙසේ වෙතත්, අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කිරීම ස්වයංසිද්ධ සෛල මරණය ප්‍රවර්ධනය කරන බවයි, එය සැමවිටම ක්ෂුද්‍ර නල බාධාවක් සමඟ සිදු නොවේ29. ඊට අමතරව, උර්සොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නයන් මෙන්, රෝග කාරකය හෝ එලිසිටරය විකෘති මූල වර්ධනයට හේතු වේද යන්න තවමත් සොයා බැලිය යුතුය. මේ අනුව, ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර සහ සයිටොස්ටෙලිටන් සම්බන්ධ කරන අණුක දැනුම විසඳිය යුතු ආකර්ශනීය ගැටළුවකි. උර්සොනික් අම්ලයට අදාළ අඩු අණුක බර සංයෝග මෙන්ම විවිධ විභවයන් සහිත ව්‍යුත්පන්න පරාසයක පැවැත්ම උපයෝගී කර ගැනීමෙන්, ඒවා නොදන්නා සෛලීය යාන්ත්‍රණයන් ඉලක්ක කර ගැනීමට අවස්ථා ලබා දිය හැකිය.
එකට ගත් කල, ක්ෂුද්‍ර නල ගතිකය මොඩියුලේට් කරන නව සංයෝග සොයා ගැනීම සහ යෙදීම ශාක සෛල හැඩය තීරණය කිරීමට යටින් පවතින සංකීර්ණ අණුක යාන්ත්‍රණ ආමන්ත්‍රණය කිරීමට ප්‍රබල ක්‍රම සපයනු ඇත. මෙම සන්දර්භය තුළ, ක්ෂුද්‍ර නල සහ ඇක්ටින් සූතිකා වලට බලපාන සහ සෛල මරණයට හේතු වන මෑතකදී සංවර්ධනය කරන ලද සංයෝග උර්මොටොනික් අම්ලය, ක්ෂුද්‍ර නල පාලනය සහ මෙම අනෙකුත් යාන්ත්‍රණ අතර සම්බන්ධතාවය විකේතනය කිරීමට අවස්ථාවක් ලබා දිය හැකිය. මේ අනුව, උර්බෙනොනික් අම්ලය භාවිතා කරන රසායනික හා ජීව විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂණය ශාක සයිටොස්කෙලිටන් පාලනය කරන අණුක නියාමන යාන්ත්‍රණ තේරුම් ගැනීමට අපට උපකාරී වනු ඇත.
2% (w/v) ගැලැක්ටෝස්, 2% (w/v) එසන්ස් පේස්ට්, 1% (w/v) බැක්ටෝ සංයුතිය අඩංගු බීජ මාධ්‍ය 110 mL අඩංගු 500 mL බැෆල් කරන ලද Erlenmeyer ෆ්ලාස්කුවකට S. werraensis MK493-CF1 එන්නත් කරන්න. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ඉරිඟු සාරය (KOGOSCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 සහ 0.2% CaCO3 අයනීකරණය කළ ජලයේ. (විෂබීජහරණයට පෙර pH අගය 7.4). බීජ සංස්කෘතීන් දින 2 ක් සඳහා භ්‍රමණ ෂේකර් (180 rpm) මත ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. ඝන අවස්ථා පැසවීම හරහා නිෂ්පාදන වගාව. බීජ සංස්කෘතිය (මිලි ලීටර් 7) සම්පීඩිත බාර්ලි ග්‍රෑම් 15 ක් (MUSO Co., Ltd., ජපානය) සහ ඩියෝනීකරණය කළ ජලය ග්‍රෑම් 25 ක් (විෂබීජහරණයට පෙර සකස් කර නැත) අඩංගු නිෂ්පාදන මාධ්‍ය ග්‍රෑම් 40 ක් අඩංගු මිලි ලීටර් 500 K-1 ෆ්ලාස්කුවකට මාරු කරන ලදී. පැසවීම දින 14 ක් අඳුරු තැනක 30°C දී සිදු කරන ලදී. පැසවීම ද්‍රව්‍ය 40 ml/බෝතලය EtOH සමඟ නිස්සාරණය කර කේන්ද්‍රාපසාරී කරන ලදී (1500 g, 4°C, මිනිත්තු 10). සංස්කෘතියේ සුපිරි ද්‍රව්‍යය (මිලි ලීටර් 60) 10% MeOH/EtOAc මිශ්‍රණයකින් නිස්සාරණය කරන ලදී. කාබනික ස්ථරය අවශේෂයක් (59.5 mg) ලබා ගැනීම සඳහා අඩු පීඩනයක් යටතේ වාෂ්ප කරන ලද අතර, එය ප්‍රතිලෝම අවධි තීරුවක (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × දිග 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 මිනිත්තු: 90% H2O/CH3CN සිට 70% H2O/CH3CN (අනුක්‍රමණය), 35–45 මිනිත්තු: 90% H2O/EtOH, 45–155 මිනිත්තු: 90% H2O/EtOH සිට 100% EtOH (අනුක්‍රමණය (අනුක්‍රමණය), 155–200 මිනිත්තු: 100% EtOH) 1.5 ml/min ප්‍රවාහ අනුපාතයකින්, කූමමොනමයිඩ් (1, 36.0 mg) සුදු පැහැති අස්ඵටික කුඩු ලෙස හුදකලා කරන ලදී.
කුමාමොටෝමයිඩ්(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ගණනය කළ අගය: 141.0659, මනින ලද අගය: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
කොලොම්බියා බීජ (Col-0) පර්යේෂණ භාවිතය සඳහා අවසරය ඇතිව Arabidopsis ජීව විද්‍යාත්මක සම්පත් මධ්‍යස්ථානයෙන් (ABRC) ලබා ගන්නා ලදී. Col-0 බීජ අපගේ රසායනාගාර තත්වයන් යටතේ ප්‍රචාරණය කර නඩත්තු කරන ලද අතර වල් වර්ගයේ Arabidopsis ශාක ලෙස භාවිතා කරන ලදී. Arabidopsis බීජ මතුපිට විෂබීජහරණය කර අර්ධ ශක්තියක් සහිත Murashige සහ Skoog මාධ්‍යයෙන් 2% සුක්‍රෝස් (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical)) සහ 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH අගය 5.7, 23 °C සහ නියත ආලෝකයේ දී ලබා ගන්නා ලදී. phs1-1 විකෘතියේ බීජ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) විසින් සපයන ලදී.
SR-1 වික්‍රියාවේ බීජ T. Hashimoto (නාරා විද්‍යා හා තාක්ෂණ ආයතනය) විසින් සපයන ලද අතර ඒවා වල් වර්ගයේ දුම්කොළ ශාක ලෙස භාවිතා කරන ලදී. ප්‍රරෝහණය ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා දුම්කොළ බීජ මතුපිට විෂබීජහරණය කර රාත්‍රී තුනක් විෂබීජහරණය කළ ජලයේ පොඟවා, පසුව pH අගය 5.7 ක් සහිත 2% සුක්‍රෝස්, 0.05% (w/v) MES සහ 0.8% ජෙලන් ගම් (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. සහ Skoog මාධ්‍යය) අඩංගු අර්ධ-ශක්ති ද්‍රාවණයක තබා නිරන්තර ආලෝකය යටතේ 23°C දී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී.
ටක්-1 වික්‍රියාව ටී. කොචි (කියෝතෝ විශ්ව විද්‍යාලය) විසින් සපයන ලද අතර එය අක්මා වර්ට් අධ්‍යයනය සඳහා සම්මත පර්යේෂණාත්මක ඒකකය ලෙස භාවිතා කරන ලදී. ජෙමා විෂබීජහරණය කරන ලද වගා කරන ලද ශාක වලින් ලබා ගන්නා ලද අතර පසුව 1% සුක්‍රෝස් සහ 0.3% ජෙලන් ගම් අඩංගු ගැම්බෝර්ග් බී 5 මාධ්‍යයේ (ෆුජිෆිල්ම් වකෝ පිරිසිදු රසායනික) ආලේප කර අඛණ්ඩ ආලෝකය යටතේ 23°C දී පුර්ව ලියාපදිංචි කරන ලදී.
දුම්කොළ BY-2 සෛල (නිකොටියානා ටැබකම් L. cv. දීප්තිමත් කහ 2) S. Hasezawa (ටෝකියෝ විශ්ව විද්‍යාලය) විසින් සපයන ලදී. BY-2 සෛල නවීකරණය කරන ලද Linsmeier සහ Skoog මාධ්‍යයෙන් 95 ගුණයකින් තනුක කරන ලද අතර සතිපතා 2,4-ඩයික්ලෝරෝෆෙනොක්සිඇසිටික් අම්ලය 32 සමඟ අතිරේකව සපයන ලදී. සෛල අත්හිටුවීම අඳුරේ 27°C දී 130 rpm දී භ්‍රමණ ෂේකර් මත මිශ්‍ර කරන ලදී. නැවුම් මාධ්‍යයේ පරිමාව මෙන් 10 ගුණයකින් සෛල සෝදා එම මාධ්‍යයේම නැවත සවි කරන්න. BY-2 පාරජම්බුල සෛල රේඛා ක්ෂුද්‍ර නල සලකුණු TagRFP-TUA6 හෝ වට්ටක්කා මොසෙයික් වෛරසය 35S ප්‍රවර්ධකය යටතේ ඇක්ටින් සූතිකා සලකුණු GFP-ABD2 ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන ලදී33,34,35 විස්තර කර ඇති පරිදි ජනනය කරන ලදී. මුල් BY-2 සෛල රේඛාව සඳහා භාවිතා කරන ලද ක්‍රියා පටිපාටිවලට සමාන ක්‍රියා පටිපාටි භාවිතයෙන් මෙම සෛල රේඛා නඩත්තු කර සමමුහුර්ත කළ හැකිය.
5% CO2 සහිත 37°C ඉන්කියුබේටරයක 10% භ්‍රෑණ ගව සෙරුමය, 1.2 U/ml පෙනිසිලින් සහ 1.2 μg/ml ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් සමඟ අතිරේකව ඩල්බෙකෝගේ නවීකරණය කරන ලද ඊගල් මාධ්‍යය (DMEM) (ලයිෆ් ටෙක්නොලොජීස්) තුළ HeLa සෛල වගා කරන ලදී.
මෙම අත්පිටපතේ විස්තර කර ඇති සියලුම අත්හදා බැලීම් ජපන් ජෛව ආරක්ෂණ රෙගුලාසි සහ මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සිදු කරන ලදී.
සංයෝග ඩයිමෙතිල් සල්ෆොක්සයිඩ් (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) තොග ද්‍රාවණ ලෙස දියකර, Arabidopsis සඳහා MS මාධ්‍යයේ සහ අක්මා වෝර්ට් සඳහා දුම්කොළ හෝ ගැම්බෝර්ග් B5 මාධ්‍යයේ තනුක කරන ලදී. මූල වර්ධන නිෂේධන පරීක්ෂණය සඳහා, තහඩුවකට බීජ 10 කට වඩා දක්වා ඇති සංයෝග හෝ DMSO අඩංගු ඒගාර් මාධ්‍යයේ වපුරන ලදී. බීජ දින 7 ක් වර්ධන කුටියක තැන්පත් කරන ලදී. බීජ පැල ඡායාරූප ගත කර මුල්වල දිග මනිනු ලැබීය. Arabidopsis ප්‍රරෝහණ පරීක්ෂණය සඳහා, තහඩුවකට බීජ 48 ක් 200 μM සංයෝගයක් හෝ DMSO අඩංගු ඒගාර් මාධ්‍යයේ වපුරන ලදී. Arabidopsis බීජ වර්ධන කුටියක වගා කරන ලද අතර ප්‍රරෝහණය වූ බීජ පැල ගණන ප්‍රරෝහණයෙන් දින 7 කට පසු (dag) ගණනය කරන ලදී. දුම්කොළ ප්‍රරෝහණ පරීක්ෂණය සඳහා, තහඩුවකට බීජ 24 ක් 200 μM KAND හෝ DMSO අඩංගු ඒගාර් මාධ්‍යයේ වපුරන ලදී. දුම්කොළ බීජ වර්ධන කුටියක වගා කරන ලද අතර දින 14 කට පසු ප්‍රරෝහණය වූ බීජ පැල ගණන ගණනය කරන ලදී. අක්මා වර්ට් වර්ධන නිෂේධන විශ්ලේෂණය සඳහා, එක් එක් තහඩුවෙන් කළල 9 ක් KAND හෝ DMSO හි දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන් අඩංගු ඒගාර් මාධ්‍යයක් මත ආලේප කර දින 14 ක් වර්ධන කුටියක තැන්පත් කරන ලදී.
මූල මෙරිස්ටම් සංවිධානය දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා 5 mg/ml ප්‍රොපිඩියම් අයඩයිඩ් (PI) සමඟ පැල්ලම් කරන ලද බීජ පැල භාවිතා කරන්න. TCS SPE කොන්ෆෝකල් ලේසර් ස්කෑනිං අන්වීක්ෂයක් (ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස්) භාවිතයෙන් ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය මගින් PI සංඥා නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
මලාමි සහ බෙන්ෆි36 විසින් විස්තර කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලයට අනුව β-ග්ලූකුරෝනිඩේස් (GUS) සමඟ මුල්වල හිස්ටොකෙමිකල් පැල්ලම් කිරීම සිදු කරන ලදී. බීජ පැල එක රැයකින් 90% ඇසිටෝන් වල සවි කර, GUS බෆරයේ 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic අම්ලය සමඟ පැය 1 ක් පැල්ලම් කර හයිඩ්‍රේටඩ් ක්ලෝරල්ඩිහයිඩ් ද්‍රාවණයක තබා ඇත. (ක්ලෝරල් හයිඩ්‍රේට් ග්‍රෑම් 8 ක්, ජලය මිලි ලීටර් 2 ක් සහ ග්ලිසරෝල් මිලි ලීටර් 1 ක්) සහ Axio Imager M1 අන්වීක්ෂයක් (කාල් සයිස්) භාවිතයෙන් අවකල්‍ය මැදිහත්වීම් ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂය මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
සිරස් අතට තැබූ තහඩු මත වගා කරන ලද දින 7 ක් වයසැති බීජ පැල මත මුල් කෝණ මනිනු ලැබීය. 6 වන පියවරේ විස්තර කර ඇති පරිදි ගුරුත්වාකර්ෂණ දෛශිකයේ දිශාවෙන් මූලයේ කෝණය මැන බලන්න.
ප්‍රොටෝකෝලය 37 හි සුළු වෙනස්කම් සහිතව, විස්තර කර ඇති පරිදි බාහික ක්ෂුද්‍ර නල වල සැකැස්ම නිරීක්ෂණය කරන ලදී. ප්‍රති-β-ටියුබුලින් ප්‍රතිදේහය (KMX-1, මර්ක් මිලිපෝර්: MAB3408) සහ ඇලෙක්සා ෆ්ලෝර් 488-සංයුක්ත ප්‍රති-මූසික IgG (තාප ෆිෂර් විද්‍යාත්මක: A32723) පිළිවෙලින් 1:1000 සහ 1:100 තනුක කිරීමේදී ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්‍රතිදේහ ලෙස භාවිතා කරන ලදී. TCS SPE කොන්ෆෝකල් ලේසර් ස්කෑනිං අන්වීක්ෂයක් (ලයිකා මයික්‍රොසිස්ටම්ස්) භාවිතයෙන් ප්‍රතිදීප්ත රූප ලබා ගන්නා ලදී. Z-ස්ටැක් රූප ලබාගෙන නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව උපරිම තීව්‍රතා ප්‍රක්ෂේපණ නිර්මාණය කරන්න.
නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සෛල ගණන් කිරීමේ කට්ටලය 8 (ඩොජින්ඩෝ) භාවිතයෙන් HeLa සෛල ප්‍රගුණන විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
600 nm (OD600) දී වර්ණාවලීක්ෂ ඡායාරූපමානයක් භාවිතයෙන් සංස්කෘතියේ සෛල ඝනත්වය මැනීම මගින් E. coli DH5α හි වර්ධනය විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
CSU-X1 confocal ස්කෑනිං උපාංගයක් (Yokogawa) සහ sCMOS කැමරාවක් (Zyla, Andor Technology) සහිත ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් සංක්‍රාන්ති BY-2 සෛලවල සයිටොස්කෙලිටල් සංවිධානය නිරීක්ෂණය කරන ලදී. ImageJ මෘදුකාංගය භාවිතා කරමින් confocal රූපවල සයිටොප්ලාස්මික් පික්සල අතර සයිටොස්කෙලිටල් පික්සලවල ප්‍රතිශතය ප්‍රමාණනය කරන ලද රූප විශ්ලේෂණය මගින් සයිටොස්කෙලිටල් ඝනත්වය තක්සේරු කරන ලදී38,39.
BY-2 සෛලවල සෛල මරණය හඳුනා ගැනීම සඳහා, සෛල අත්හිටුවීමේ කොටසක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී 0.05% එවන්ස් නිල් සමඟ මිනිත්තු 10 ක් පුර්ව ගන්වන ලදී. මියගිය සෛලවල තෝරාගත් එවන්ස් නිල් පැල්ලම් කිරීම රඳා පවතින්නේ නොවෙනස්ව පවතින ප්ලාස්මා පටලය මගින් ශක්‍ය සෛල වලින් සායම් නිස්සාරණය කිරීම මත ය. දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර අන්වීක්ෂයක් (BX53, ඔලිම්පස්) භාවිතයෙන් පැල්ලම් සහිත සෛල නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
37°C සහ 5% CO2 දී ආර්ද්‍රිත ඉන්කියුබේටරයක 10% FBS සමඟ අතිරේකව DMEM හි HeLa සෛල වගා කරන ලදී. සෛල 37°C දී පැය 6 ක් සඳහා 100 μM KAND 11, කුමාමොනමික් අම්ලය 6, කුමාමොනමයිඩ් 1, 100 ng/ml කොල්සමිඩ් (Gibco), හෝ 100 ng/ml නොකොඩ්මේස් (සිග්මා) සමඟ ප්‍රතිකාර කරන ලදී. සෛල MetOH සමඟ මිනිත්තු 10 ක් සහ පසුව කාමර උෂ්ණත්වයේ දී මිනිත්තු 5 ක් ඇසිටේට් සමඟ සවි කරන ලදී. ස්ථාවර සෛල 0.5% BSA/PBS හි තනුක කර පැය 2 ක් සඳහා β-ටියුබුලින් ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය (1D4A4, Proteintech: 66240-1) සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී, TBST සමඟ 3 වතාවක් සෝදා, පසුව ඇලෙක්සා ෆ්ලෝර් එළු ප්‍රතිදේහය සමඟ ඉන්කියුබේට් කරන ලදී. පැය 488 1. – මවුස් IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) සහ 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS හි තනුක කර ඇත. TBST සමඟ තුන් වරක් සේදීමෙන් පසු, Nikon Eclipse Ti-E ප්‍රතිලෝම අන්වීක්ෂයක පැල්ලම් සහිත සෛල නිරීක්ෂණය කරන ලදී. MetaMorph මෘදුකාංගය (අණුක උපාංග) භාවිතයෙන් සිසිල් කරන ලද Hamamatsu ORCA-R2 CCD කැමරාවකින් රූප ග්‍රහණය කර ගන්නා ලදී.