Nature.com වෙත පිවිසීම ගැන ඔබට ස්තුතියි.ඔබ භාවිතා කරන බ්‍රවුසරයේ අනුවාදයට සීමිත CSS සහය ඇත.හොඳම ප්‍රතිඵල සඳහා, ඔබ ඔබේ බ්‍රවුසරයේ නව අනුවාදයක් භාවිත කරන ලෙස අපි නිර්දේශ කරමු (නැතහොත් Internet Explorer හි අනුකූලතා ප්‍රකාරය අක්‍රිය කරන්න).මේ අතරතුර, අඛණ්ඩ සහාය සහතික කිරීම සඳහා, අපි මෝස්තරය හෝ JavaScript නොමැතිව වෙබ් අඩවිය පෙන්වමු.
ස්වභාවික නිෂ්පාදන සොයා ගැනීම සහ ප්රයෝජනවත් භාවිතය මිනිස් ජීවිතය වැඩිදියුණු කිරීමට උපකාරී වේ.වල් පැලෑටි පාලනය සඳහා වල් නාශක ලෙස ශාක වර්ධනයට බාධා කරන රසායනික ද්රව්ය බහුලව භාවිතා වේ.විවිධ වර්ගයේ වල් නාශක භාවිතා කිරීමේ අවශ්‍යතාවය හේතුවෙන් නව ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණයන් සහිත සංයෝග හඳුනාගැනීමේ අවශ්‍යතාවයක් පවතී.මෙම අධ්‍යයනයේ දී, අපි Streptomyces werraensis MK493-CF1 වෙතින් N -alkoxypyrrole සංයෝගය, coumamonamide නවකතාවක් සොයා ගෙන සම්පූර්ණ සංස්ලේෂණ ක්‍රියාවලිය ස්ථාපිත කළෙමු.ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් විශ්ලේෂණයන් හරහා, අපි urs-monoamic අම්ලය urs-monoamide හි කෘතිම අතරමැදියක් සහ විභවයක් බව සොයා ගත්තෙමු.ශාක වර්ධන නිෂේධකය.මීට අමතරව, අපි HeLa සෛල වර්ධනයට අහිතකර ලෙස බල නොපාමින් ඉහළ වල් නාශක ක්‍රියාකාරකම් ඇති urbenyloxy ව්‍යුත්පන්න (UDA) ඇතුළු විවිධ urbenonic අම්ල ව්යුත්පන්නයන් වර්ධනය කර ඇත.urmotonic අම්ල ව්යුත්පන්නයන් ශාක ක්ෂුද්ර නාල වලට බාධා කරන බව ද අපි සොයා ගත්තෙමු;ඊට අමතරව, KAND ඇක්ටින් සූතිකා වලට බලපාන අතර සෛල මරණයට හේතු වේ;මෙම බහුවිධ බලපෑම් දන්නා ක්ෂුද්ර නල නිෂේධකවලට වඩා වෙනස් වන අතර නව වල් නාශක සංවර්ධනය කිරීමේදී වැදගත් වාසියක් නියෝජනය කරන ursonic අම්ලය සඳහා නව ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරයි.
ප්රයෝජනවත් ස්වභාවික නිෂ්පාදන සහ ඒවායේ ව්යුත්පන්නයන් සොයා ගැනීම සහ ප්රායෝගික භාවිතය මිනිස් ජීවිතයේ ගුණාත්මක භාවය වැඩිදියුණු කිරීමේ මාධ්යයකි.ක්ෂුද්ර ජීවීන්, ශාක සහ කෘමීන් විසින් නිපදවන ද්විතියික පරිවෘත්තීය වෛද්‍ය විද්‍යාවේ සහ කෘෂිකර්මාන්තයේ ප්‍රධාන දියුණුවට හේතු වී ඇත.බොහෝ ප්‍රතිජීවක සහ ලියුකේමියාවට එරෙහි ඖෂධ ස්වභාවික නිෂ්පාදනවලින් නිපදවා ඇත.මීට අමතරව, විවිධ වර්ගවලපළිබෝධනාශක, කෘෂිකාර්මික කටයුතු සඳහා මෙම ස්වභාවික නිෂ්පාදන වලින් දිලීර නාශක සහ වල් නාශක නිස්සාරණය කරනු ලැබේ.විශේෂයෙන්ම, වල් මර්දන වල්නාශක නවීන කෘෂිකර්මාන්තයේ බෝග අස්වැන්න වැඩි කිරීම සඳහා වැදගත් මෙවලම් වන අතර, විවිධ වර්ගයේ සංයෝග දැනටමත් වාණිජමය වශයෙන් භාවිතා වේ.ප්‍රභාසංශ්ලේෂණය, ඇමයිනෝ අම්ල පරිවෘත්තිය, සෛල බිත්ති සංස්ලේෂණය, මයිටෝසිස් නියාමනය, ෆයිටෝහෝමෝන සංඥා කිරීම හෝ ප්‍රෝටීන් සංස්ලේෂණය වැනි ශාකවල සෛලීය ක්‍රියාවලීන් කිහිපයක් වල් නාශකවල සාමාන්‍ය ඉලක්ක ලෙස සැලකේ.ක්ෂුද්ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වන සංයෝග මයිටොටික් නියාමනයට බලපෑම් කිරීමෙන් ශාක වර්ධනයට බලපාන පොදු වල්නාශක කාණ්ඩයකි.
ක්ෂුද්ර නාල යනු සයිටොස්කෙලිටනයේ කොටස් වන අතර යුකැරියෝටික් සෛල තුළ බහුලව සංරක්ෂණය කර ඇත.Tubulin heterodimer සමන්විත වන්නේ α-tubulin සහ β-tubulin මගින් රේඛීය ක්ෂුද්ර නාලිකා මූලාකෘති සාදනු ලබන අතර ප්‍රොටෝෆිලමන්ට් 13 ක් සිලින්ඩරාකාර ව්‍යුහයක් සාදයි.සෛල හැඩය, සෛල බෙදීම සහ අන්තර් සෛලීය ප්‍රවාහනය ඇතුළුව ශාක සෛල තුළ ක්ෂුද්ර නල බහු භූමිකාවන් ඉටු කරයි.ශාක සෛලවල අන්තර් ප්ලාස්මා පටලයට යටින් ක්ෂුද්ර ටියුබියුලස් අඩංගු වන අතර, මෙම ඊනියා බාහික ක්ෂුද්ර ටියුබුල් සෙලියුලෝස් සින්තේස් සංකීර්ණ නියාමනය කිරීම හරහා සෙලියුලෝස් ක්ෂුද්ර ෆයිබ්‍රිල් සංවිධානය පාලනය කරනු ඇතැයි සැලකේ.මූල එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්ර ටියුබුල්, මූල තුඩ වේගයෙන් දිගු වන කලාපයේ පිහිටා ඇති අතර, සෙලියුලෝස් ක්ෂුද්ර තන්තු මෙම ක්ෂුද්ර නල අනුගමනය කර සෛල ප්‍රසාරණයේ දිශාව සීමා කරයි, එමඟින් ඇනිසොට්‍රොපික් සෛල දිගු කිරීම ප්‍රවර්ධනය කරයි.එබැවින් ක්ෂුද්ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය ශාක රූප විද්‍යාවට සමීපව සම්බන්ධ වේ.ටියුබියුලින් කේතනය කරන ජානවල ඇමයිනෝ අම්ල ආදේශන බාහිකයේ ක්ෂුද්ර ටියුබියුලේ අරා සහ අරාබි 6,7 හි වම් හෝ දකුණු පැත්තේ වර්ධනයට හේතු වේ.ඒ හා සමානව, ක්ෂුද්ර නල ගතිකත්වය නියාමනය කරන ක්ෂුද්ර නල ආශ්‍රිත ප්‍රෝටීන වල විකෘති කිරීම් ද විකෘති මූල වර්ධනයට හේතු විය හැක8,9,10,11,12,13.මීට අමතරව, pretilachlor ලෙසද හැඳින්වෙන, disopyramide වැනි ක්ෂුද්ර නාලිකා කඩාකප්පල් කරන වල් නාශක සමඟ ප්රතිකාර කිරීම ද වම් පැත්තේ ආනත මූල වර්ධනයට හේතු වේ.මෙම දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ ශාක වර්ධනයේ දිශාව තීරණය කිරීම සඳහා ක්ෂුද්ර නල ක්රියාකාරිත්වයේ නිශ්චිත නියාමනය ඉතා වැදගත් බවයි.
විවිධ වර්ගයේ ක්ෂුද්ර නල නිෂේධක සොයාගෙන ඇති අතර, මෙම ඖෂධ සයිටොස්කෙලිටල් පර්යේෂණ සඳහා මෙන්ම කෘෂිකර්මාන්තයට සහ වෛද්‍ය විද්‍යාවට සැලකිය යුතු දායකත්වයක් ලබා දී ඇත.විශේෂයෙන්, ඔරිසාලින්, ඩයිනයිට්‍රොඇනිලීන් සංයෝග, ඩිසොපිරමිඩ්, බෙන්සාමයිඩ් ආශ්‍රිත සංයෝග සහ ඒවායේ ප්‍රතිසම ක්ෂුද්ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය වළක්වන අතර එමඟින් ශාක වර්ධනය වළක්වයි.එබැවින් ඒවා වල් නාශක ලෙස බහුලව භාවිතා වේ.කෙසේ වෙතත්, ක්ෂුද්ර නල ශාක හා සත්ව සෛලවල වැදගත් අංගයක් වන බැවින්, බොහෝ ක්ෂුද්ර නල නිෂේධක සෛල වර්ග දෙකටම සයිටොටොක්සික් වේ.එබැවින්, වල් නාශක ලෙස ඔවුන්ගේ පිළිගත් උපයෝගීතාව තිබියදීත්, ප්රායෝගික අරමුණු සඳහා ප්‍රති-ක්ෂුද්ර ටියුබුල් කාරක සීමිත සංඛ්‍යාවක් භාවිතා වේ.
Streptomyces යනු Streptomyces පවුලේ කුලයට අයත් වන අතර එයට aerobic, gram-positive, filamentous බැක්ටීරියා ඇතුළත් වන අතර පුළුල් පරාසයක ද්විතියික පරිවෘත්තීය නිෂ්පාදනය කිරීමේ හැකියාව සඳහා පුළුල් ලෙස ප්‍රසිද්ධය.එමනිසා, එය නව ජීව විද්‍යාත්මකව ක්‍රියාකාරී ස්වාභාවික නිෂ්පාදනවල වැදගත්ම ප්‍රභවයක් ලෙස සැලකේ.වත්මන් අධ්‍යයනයේ දී, අපි Streptomyces werraensis MK493-CF1 සහ S. werraensis ISP 5486 වෙතින් හුදකලා වූ coumamonamide නම් නව සංයෝගයක් සොයා ගත්තෙමු. වර්ණාවලි විශ්ලේෂණය සහ සම්පූර්ණ වර්ණාවලි විශ්ලේෂණය භාවිතා කරමින්, coumamonamide හි ව්යුහය සංලක්ෂිත වූ අතර එහි අද්විතීය N-alkoxyeleton තීරණය විය.සංශ්ලේෂණය.Ursmonic acid, ursmonoamide සහ එහි ව්‍යුත්පන්නවල කෘතිම අතරමැදියක් වන Arabidopsis thaliana නම් ජනප්‍රිය ආදර්ශ ශාකයේ වර්ධනය හා ප්රරෝහණය වළක්වන බව සොයා ගන්නා ලදී.ව්යුහය-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතා අධ්‍යයනයක දී, අපි සොයා ගත්තේ උර්සොනික් අම්ලයේ (KAND) නොනිලොක්සි ව්‍යුත්පන්න ලෙස හැඳින්වෙන උර්සොනික් අම්ලයට වෙනස් කරන ලද C9 සමඟ සංයෝගයක් වර්ධනයට සහ ප්‍රරෝහණයට ඇති බාධාකාරී බලපෑම සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි කරන බවයි.විශේෂයෙන්, අලුතින් සොයාගත් ශාක වර්ධන නිෂේධකය දුම්කොළ සහ අක්මාවේ වර්ධනයට බලපෑ අතර බැක්ටීරියා හෝ HeLa සෛල වලට සයිටොටොක්සික් නොවේ.එපමනක් නොව, සමහර urmotonic අම්ල ව්යුත්පන්නයන් විකෘති මූල සංසිද්ධියක් ඇති කරයි, මෙම ව්යුත්පන්නයන් සෘජුව හෝ වක්‍රව ක්ෂුද්ර නල වලට බලපාන බව අඟවයි.මෙම අදහසට අනුකූලව, ප්‍රතිශක්තිකරණ රසායනිකව හෝ ප්‍රතිදීප්ත ප්‍රෝටීන සමඟ ලේබල් කර ඇති ක්ෂුද්ර නල පිළිබඳ අපගේ නිරීක්ෂණ පෙන්නුම් කරන්නේ KAND ප්‍රතිකාරය ක්ෂුද්ර නල ඩිපොලිමරයිස් කරන බවයි.ඊට අමතරව, කුමමොටොනික් අම්ල ව්යුත්පන්නයන් සමඟ ප්රතිකාර කිරීම ඇක්ටින් ක්ෂුද්ර තන්තු වලට බාධා ඇති කළේය.මේ අනුව, අපි නව ශාක වර්ධන නිෂේධනයක් සොයාගෙන ඇති අතර එහි අද්විතීය ක්‍රියාකාරී යාන්ත්රණය සයිටොස්කෙලිටන් විනාශ කිරීම ඇතුළත් වේ.
Strain MK493-CF1 ටෝකියෝ හි Shinagawa-ku හි පසෙන් හුදකලා විය.MK493-CF1 වික්‍රියා හොඳින් අතු සහිත ස්ට්‍රෝමාල් මයිසිලියම් සාදන ලදී.16S ribosomal RNA ජානයේ (1422 bp) අර්ධ අනුපිළිවෙල තීරණය කරන ලදී.මෙම වික්‍රියාව S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: සාමාන්‍ය වික්‍රියාව, 99.93%) ට බෙහෙවින් සමාන ය.මෙම ප්‍රතිඵලය මත පදනම්ව, මෙම වික්‍රියාව S. werraensis වර්ගයේ වික්‍රියාවට සමීපව සම්බන්ධ බව තීරණය විය.එබැවින්, අපි මෙම වික්‍රියාව S. werraensis MK493-CF1 ලෙස තාවකාලිකව නම් කළෙමු.S. werraensis ISP 5486T ද එම ජෛව ක්‍රියාකාරී සංයෝග නිපදවයි.මෙම ක්ෂුද්ර ජීවියාගෙන් ස්වභාවික නිෂ්පාදන ලබා ගැනීම සඳහා මුල් කාලීන පර්යේෂණ සිදු නොවූ බැවින්, තවදුරටත් රසායනික පර්යේෂණ සිදු කරන ලදී.S. werraensis MK493-CF1 බාර්ලි මාධ්‍යයේ දින 14ක් 30°C දී ඝන තත්වයේ පැසවීම මගින් වගා කිරීමෙන් පසු මාධ්‍යය 50% EtOH සමඟ නිස්සාරණය කර ඇත.59.5 mg බොරතෙල් සාරය ලබා ගැනීම සඳහා සාම්පල මිලි ලීටර් 60 ක් වියළන ලදී.N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, coumamonamide, 36.0 mg ලෙස නම් කර ඇත) ලබා දීම සඳහා බොරතෙල් සාරය HPLC ප්‍රතිලෝම අදියරට යටත් කරන ලදී.1 හි මුළු මුදල බොරතෙල් නිස්සාරණයෙන් 60% ක් පමණ වේ.එබැවින්, අපි කුමමොටොමයිඩ 1 හි ගුණාංග විස්තරාත්මකව අධ්යයනය කිරීමට තීරණය කළෙමු.
Coumamonamide 1 යනු සුදු අස්ඵටික කුඩු වන අතර අධි විභේදන ස්කන්ධ වර්ණාවලීක්ෂය (HRESIMS) C6H8N2O2 (රූපය 1) තහවුරු කරයි.මෙම සංයෝගයේ C2-ආදේශක pyrrole ඛණ්ඩනය δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR 5 Hzz වර්ණාවලිය: 4.5 මගින් සංලක්ෂිත වේ. , H-5) සහ δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), සහ 13C NMR වර්ණාවලිය sp2 කාබන් පරමාණු හතරක් පවතින බව පෙන්නුම් කරයි.δC 161.1 හි C-3 ප්‍රෝටෝනයේ සිට ඇමයිඩ් කාබොනයිල් කාබන් දක්වා HMBC සහසම්බන්ධය මගින් C2 ස්ථානයේ ඇමයිඩ් කාණ්ඩයක් තිබීම තක්සේරු කරන ලදී.මීට අමතරව, δH 4.10 (3H, S) සහ δC 68.3 හි 1 H සහ 13 C NMR උපරිම අගයන් අණුවෙහි N-methoxy කාණ්ඩ පවතින බව පෙන්නුම් කරයි.වැඩිදියුණු කළ වෙනස වර්ණාවලීක්ෂය සහ න්‍යෂ්ටික ඕවර්හවුසර් කෙටි යෙදුම (NOEDF) වැනි වර්ණාවලීක්ෂ විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් මෙතොක්සි කාණ්ඩයේ නිවැරදි පිහිටීම තවමත් නිර්ණය කර නොතිබුණද, N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide පළමු අපේක්ෂක සංයෝගය බවට පත්විය.
1 හි නිවැරදි ව්යුහය තීරණය කිරීම සඳහා, සම්පූර්ණ සංශ්ලේෂණයක් සිදු කරන ලදී (රූපය 2a).වාණිජමය වශයෙන් ලබා ගත හැකි 2-aminopyridine 2 m-CPBA සමඟ ප්රතිකාර කිරීමෙන් ප්‍රමාණාත්මක අස්වැන්නෙහි අනුරූප N-ඔක්සයිඩ් 3 ඇති විය.2 හි 2-aminoazidation පසු, Abramovich විසින් විස්තර කරන ලද cyclocondensation ප්‍රතික්‍රියාව ග්‍රෑම් වලින් අපේක්ෂිත 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ලබා ගැනීම සඳහා 90 ° C දී බෙන්සීන් හි සිදු කරන ලදී.වේගය 60% (අදියර දෙකක්).15,16.4 හි මෙතිලේෂන් සහ ජල විච්ඡේදනය 1-methoxy-1H-pyrrole-2-කාබොක්සිලික් අම්ලය ("cumotonic අම්ලය" ලෙස හැඳින්වේ, 6) හොඳ අස්වැන්නක් (70%, පියවර දෙකක්) ලබා දුන්නේය.අවසාන වශයෙන්, ඇසිඩ් ක්ලෝරයිඩ් අතරමැදි 6 හරහා ජලීය ඇමෝනියා භාවිතා කිරීමෙන් 98% අස්වැන්නෙන් Kumamoto amide 1 ලබා දුන්නේය.සංස්ලේෂණය කරන ලද 1 හි සියලුම වර්ණාවලි දත්ත හුදකලා 1 ට සමාන වූ බැවින් 1 හි ව්යුහය තීරණය කරන ලදී;
Urbenamide සහ urbenic අම්ලයේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් පිළිබඳ සාමාන්‍ය සංශ්ලේෂණය සහ විශ්ලේෂණය.(අ) Kumamoto amide හි සම්පූර්ණ සංස්ලේෂණය.(ආ) දින හතක් වයසැති වල්-වර්ගයේ Arabidopsis Columbia (Col) බීජ පැල සඳහන් කරන ලද සාන්ද්‍රණයන්හි Coumamonamide 6 හෝ coumamonamide 1 අඩංගු Murashige සහ Skoog (MS) තහඩු මත වගා කරන ලදී.පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී.
පළමුව, අපි ශාක වර්ධනය මොඩියුලේට් කිරීමට ඇති හැකියාව සඳහා urbenamide සහ එහි අතරමැදි වල ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් තක්සේරු කළෙමු.අපි MS agar මාධ්‍යයට ursmonamide 1 හෝ ursmonic acid 6 විවිධ සාන්ද්‍රණයන් එකතු කළ අතර මෙම මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද Arabidopsis thaliana බීජ පැල.මෙම විශ්ලේෂණයන් පෙන්නුම් කළේ 6 හි ඉහළ සාන්ද්‍රණය (500 μM) මූල වර්ධනයට බාධා කරන බවයි (රූපය 2b).මීළඟට, අපි 6 හි N1 ස්ථානය ආදේශ කිරීමෙන් විවිධ ව්යුත්පන්නයන් උත්පාදනය කර ඒවා මත ව්යුහය-ක්‍රියාකාරකම් සම්බන්ධතා අධ්යයනය සිදු කළෙමු (ප්‍රතිසම සංස්ලේෂණ ක්‍රියාවලිය උපකාරක තොරතුරු (SI) හි විස්තර කර ඇත).Arabidopsis බීජ පැල 50 μM ursonic අම්ල ව්‍යුත්පන්න අඩංගු මාධ්‍යයක් මත වගා කරන ලද අතර මුල් දිග මනිනු ලැබේ.පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි.රූප සටහන 3a, b, සහ S1 හි පෙන්වා ඇති පරිදි, coumamo අම්ලවල N1 ස්ථානයේ විවිධ දිග රේඛීය ඇල්කොක්සි දාම (9, 10, 11, 12, සහ 13) හෝ විශාල ඇල්කොක්සි දාම (15, 16, සහ 17) ඇත.ව්යුත්පන්නයන් මුල් වර්ධනයේ සැලකිය යුතු බාධාවක් පෙන්නුම් කරයි.ඊට අමතරව, අපි 200 μM 10, 11, හෝ 17 වල යෙදීම ප්‍රරෝහණයට බාධා කරන බව සොයා ගත්තෙමු (Fig. 3c සහ S2).
Kumamoto amide සහ ඒ ආශ්‍රිත සංයෝගවල ව්‍යුහ-ක්‍රියාකාරී සම්බන්ධතාවය අධ්යයනය කිරීම.(අ) ඇනලොග් වල ව්යුහය සහ සංස්ලේෂණ යෝජනා ක්‍රමය.(ආ) 50 μM coumamonamide ව්යුත්පන්නයන් සහිත හෝ නැතිව MS මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද දින 7ක් වයසැති බීජ පැලවල මුල් දිග ප්‍රමාණ කිරීම.තරු ලකුණු ව්යාජ ප්රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t test, p<0.05).n>18. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD ලෙස පෙන්වයි.nt යනු "පරීක්ෂා නොකළ" යන්නෙන් අදහස් වන්නේ බීජ වලින් 50% කට වඩා ප්රරෝහණය නොවූ බැවිනි.(ඇ) 200 μM coumamonamide සහ ඒ ආශ්‍රිත සංයෝග සහිත හෝ රහිත MS මාධ්‍යයේ දින 7ක් පුරාවට ප්රරෝහණය වන ප්‍රරෝහණ අනුපාතය ප්‍රමාණනය කිරීම.තරු ලකුණු ව්යාජ ප්රතිකාර (chi-square පරීක්ෂණය) සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි.n=96.
සිත්ගන්නා කරුණ නම්, C9 ට වඩා දිගු ඇල්කයිල් පැති දාම එකතු කිරීම නිෂේධන ක්‍රියාකාරකම් අඩු කරන අතර, කුමාමොටොයික් අම්ලය ආශ්‍රිත සංයෝගවලට ඒවායේ ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රදර්ශනය කිරීමට යම් ප්‍රමාණයක පැති දාම අවශ්‍ය බව යෝජනා කරයි.
ව්‍යුහ-ක්‍රියාකාරී සම්බන්ධතා විශ්ලේෂණයෙන් පෙන්නුම් කළේ C9 ursonic අම්ලය ලෙස වෙනස් කර ඇති බවත්, ursonic අම්ලයේ nonyloxy ව්‍යුත්පන්නය (මෙතැන් සිට KAND 11 ලෙස හඳුන්වනු ලබන) වඩාත් ඵලදායී ශාක වර්ධන නිෂේධකය වූ නිසාත්, KAND 11 හි වඩාත් සවිස්තරාත්මක ගුනාංගීකරනය සිදු කළෙමු. Arabidopsis ප්රතිකාර 50 μM KAND 11 සමඟින් සම්පූර්ණයෙන්ම වාගේ ප්රරෝහණය වැළැක්වූ අතර, KAND 11 හි අඩු සාන්ද්‍රණය (40, 30, 20, හෝ 10 μM) මාත්‍රාව මත යැපෙන ආකාරයෙන් මූල වර්ධනය වළක්වයි (රූපය 4a, b).KAND 11 මූල meristem ශක්‍යතාවයට බලපාන්නේද යන්න පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි propidium iodide (PI) සහ meristem ප්‍රදේශයේ ප්‍රමාණය මනින ලද root meristems පරීක්ෂා කළෙමු.25 μM KAND-11 අඩංගු මාධ්‍යයක වගා කරන ලද බීජ පැලවල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය 151.1 ± 32.5 μm වූ අතර DMSO අඩංගු පාලන මාධ්‍යයක් මත වගා කරන ලද බීජ පැලවල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය 264.7 ± 30.8 μm විය (රූපය 4c, , KAND-11 සෛලීය ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රතිස්ථාපනය කරන බව පෙන්නුම් කරයි.පැතිරෙනවා.මූල meristem.මෙයට අනුකූලව, KAND 11 ප්‍රතිකාරය මගින් සෛල බෙදීමේ සලකුණු CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS සංඥා මූල meristem හි ප්‍රමාණය අඩු විය (රූපය 4e) 17 .මෙම ප්‍රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ සෛල ප්‍රගුණන ක්‍රියාකාරකම් අඩු කිරීමෙන් KAND 11 මූල වර්ධනය වළක්වන බවයි.
වර්ධනය මත urbenonic අම්ල ව්‍යුත්පන්න (urbenyloxy ව්‍යුත්පන්න) වල නිෂේධනීය බලපෑම විශ්ලේෂණය කිරීම.(අ) KAND 11 හි සඳහන් සාන්ද්‍රණය සහිත MS තහඩු මත වැඩුණු දින 7ක් පැරණි වල් වර්ගයේ Col බීජ පැල. පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී.(ආ) මූලයේ දිග ප්‍රමාණ කිරීම.අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (ටුකී එච්එස්ඩී පරීක්ෂණය, පි<0.05).n>16. දත්ත මධ්‍යන්‍ය ± SD ලෙස පෙන්වයි.(ඇ) 25 μM KAND සහිත හෝ නැතිව MS තහඩු මත වගා කරන ලද ප්‍රොපිඩියම් අයඩයිඩ් පැල්ලම් සහිත වල්-වර්ගයේ කෝල් මුල්වල කොන්ෆෝකල් අන්වීක්ෂය 11. සුදු වරහන් මඟින් මූල මෙරිස්ටම් පෙන්නුම් කරයි.පරිමාණ තීරුව = 100 µm.(d) මූල මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය ප්‍රමාණ කිරීම (n = 10 සිට 11 දක්වා).t-test භාවිතයෙන් සංඛ්‍යානමය වෙනස්කම් තීරණය කරන ලදී (p<0.05).තීරු සාමාන්‍ය මෙරිස්ටම් ප්‍රමාණය නියෝජනය කරයි.(ඉ) CDKB2 නිර්මිතය අඩංගු root meristem එකක අවකල මැදිහත්වීම් ප්‍රතිවිරුද්ධ (DIC) අන්වීක්ෂය;1pro: CDKB2;25 µM KAND තක්සේරුවකින් හෝ රහිතව MS තහඩු මත වගා කරන ලද දින 5ක් වයසැති බීජ පැල මත 1-GUS පැල්ලම් සහ පැල්ලම් කර ඇත.
KAND 11 හි ෆයිටොටොක්සිසිටි බව තවත් ද්විකෝටිලඩෝනස් ශාකයක් වන දුම්කොළ (Nicotiana tabacum) සහ ප්‍රධාන භූමි ශාක ආකෘති ජීවියෙකු වන ලිවර්වෝට් (Marchantia polymorpha) භාවිතයෙන් තවදුරටත් පරීක්ෂා කරන ලදී.Arabidopsis වලදී මෙන්ම, 25 μM KAND 11 අඩංගු මධ්‍යම මත වගා කරන ලද දුම්කොළ SR-1 බීජ පැල කෙටි මුල් නිපදවයි (රූපය 5a).මීට අමතරව, බීජ 48 න් 40 ක්ම 200 μM KAND 11 අඩංගු තහඩු මත ප්රරෝහණය වූ අතර, බීජ 48ම ව්යාජ ප්රතිකාර කළ මාධ්‍ය මත ප්රරෝහණය වී ඇති අතර, එයින් පෙන්නුම් කරන්නේ KAND හි ඉහළ සාන්ද්‍රණය සැලකිය යුතු බවයි (p< 0.05;chi test -square) දුම්කොළ ප්රරෝහණය වළක්වයි.(රූපය 5b).මීට අමතරව, අක්මාවේ බැක්ටීරියා වර්ධනය වළක්වන KAND 11 හි සාන්ද්‍රණය Arabidopsis හි ඵලදායී සාන්ද්‍රණයට සමාන විය (රූපය 5c).මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ KAND 11 මගින් විවිධ ශාකවල වර්ධනය වැළැක්විය හැකි බවයි.අපි පසුව, ඉහළ සත්ව සහ බැක්ටීරියා සෛලවල නියෝජිතයන් ලෙස, අනෙකුත් ජීවීන්ගේ, එනම් මානව HeLa සෛල සහ Escherichia coli වික්‍රියා DH5α වල Bear monoamide ආශ්‍රිත සංයෝගවල ඇති විය හැකි සයිටොටොක්සිසිටි බව විමර්ශනය කළෙමු.සෛල ප්‍රගුණනය කිරීමේ පරීක්ෂණ මාලාවක දී, coumamonamide 1, coumamonamidic අම්ලය 6 සහ KAND 11 100 μM සාන්ද්‍රණයකදී HeLa හෝ E. coli සෛල වර්ධනයට බල නොපාන බව අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු (Fig. 5d,e).
Arabidopsis නොවන ජීවීන්ගේ KAND 11 හි වර්ධන නිෂේධනය.(a) සති දෙකක් වයසැති වල්-වර්ගයේ SR-1 දුම්කොළ බීජ පැල 25 μM KAND 11 අඩංගු සිරස් අතට ස්ථානගත කර ඇති MS තහඩු මත වගා කරන ලදී. (b) සති දෙකක වල්-වර්ගයේ SR-1 දුම්කොළ බීජ පැල තිරස් අතට ස්ථානගත කර වගා කරන ලදී. 200 μM KAND අඩංගු MS තහඩු 11. ( c) KAND 11 හි සඳහන් සාන්ද්‍රණයන් සහිත Gamborg B5 තහඩු මත වගා කරන ලද සති දෙකක් පැරණි වල්-වර්ගයේ Tak-1 ලිවර්වෝට් අංකුර. රතු ඊතල පෙන්නුම් කරන්නේ සති දෙකක පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කාලය තුළ වර්ධනය වීම නතර වූ බීජාණු ය. කාලය.(d) HeLa සෛලවල සෛල ප්‍රගුණනය විශ්ලේෂණය.සෛල ගණන් කිරීමේ කට්ටලය 8 (Dojindo) භාවිතයෙන් ස්ථාවර කාල පරතරයන් තුළ ශක්‍ය සෛල ගණන මනිනු ලැබේ.පාලනයක් ලෙස, HeLa සෛල 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) සමඟ ප්රතිකාර කරන ලදී, එය RNA පොලිමරේස් පිටපත් කිරීම වළක්වන අතර සෛල මරණයට හේතු වේ.විශ්ලේෂණයන් තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලදී.(e) E. coli සෛල ප්‍රගුණනය තක්සේරුව.E. coli වර්ධනය OD600 මැනීම මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.පාලනයක් ලෙස, සෛල බැක්ටීරියා සෛල බිත්ති සංශ්ලේෂණය වළක්වන 50 μg/ml ampicillin (Amp) සමඟ ප්රතිකාර කරන ලදී.විශ්ලේෂණයන් තුන් ගුණයකින් සිදු කරන ලදී.
උරමිඩ් ආශ්‍රිත සංයෝග නිසා ඇති වන සයිටොටොක්සිසිටි ක්‍රියාකාරීත්වයේ යාන්ත්රණය විකේතනය කිරීම සඳහා, අපි මධ්‍යස්ථ නිෂේධනීය බලපෑම් සහිත urbenic අම්ල ව්යුත්පන්නයන් නැවත විශ්ලේෂණය කළෙමු.පින්තූරයේ පෙන්වා ඇති පරිදි.රූප 2b, 6a හි පෙන්වා ඇති පරිදි, urmotonic අම්ලය 6 හි ඉහළ සාන්ද්‍රණය (200 μM) අඩංගු agar තහඩු මත වගා කරන ලද බීජ පැල කෙටි සහ වම් වක්‍ර මුල් (θ = - 23.7 ± 6.1) නිපදවන අතර, පාලන මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද බීජ පැල, බීජ පැල පාහේ සෘජු මුල් නිපදවයි (θ = - 3.8 ± 7.1).මෙම ලාක්ෂණික ආනත වර්ධනය cortical microtubules14,18 හි අක්‍රියතාවයේ ප්‍රතිඵලයක් ලෙස හැඳින්වේ.මෙම සොයාගැනීම් වලට අනුකූලව, ක්ෂුද්ර නාල අස්ථායීකරන ඖෂධ disopyramide සහ oryzalin අපගේ වර්ධන තත්ව යටතේ සමාන මුල් නැඹුරුවක් ඇති කළේය (Fig. 2b, 6a).ඒ අතරම, අපි උර්මොටොනික් අම්ල ව්යුත්පන්නයන් පරීක්ෂා කර ඒවායින් කිහිපයක් තෝරා ගත්තෙමු, ඇතැම් සාන්ද්‍රණයන්හිදී, ආනත මූල වර්ධනයට හේතු විය.8, 9 සහ 15 යන සංයෝග පිළිවෙලින් 75 μM, 50 μM සහ 40 μM හි මූල වර්ධනයේ දිශාව වෙනස් කරන ලද අතර, මෙම සංයෝග මගින් ක්ෂුද්ර නල ඵලදායි ලෙස අස්ථාවර කළ හැකි බව පෙන්නුම් කරයි (රූපය 2b, 6a).අපි වඩාත් ප්‍රබල උර්සොලික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නය වන KAND 11, අඩු සාන්ද්‍රණයකින් (15 µM) පරීක්ෂා කළ අතර, KAND 11 යෙදීමෙන් මුල් වර්ධනය වළක්වන බවත්, වමට බෑවුමට නැඹුරු වුවද මූල වර්ධනයේ දිශාව අසමාන බවත් සොයා ගන්නා ලදී. රූපය C3)..ක්ෂුද්ර නාල අස්ථායීකරන ඖෂධවල ඉහළ සාන්ද්‍රණය සමහර විට මුල් ඇලවීමට වඩා ශාක වර්ධනයට බාධා කරන බැවින්, මූල එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්ර නාල නිරීක්ෂණය කිරීමෙන් KAND 11 ක්ෂුද්ර නාල වලට බලපෑම් කිරීමේ හැකියාව අපි පසුව තක්සේරු කළෙමු.25 μM KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද බීජ පැල මුල්වල එපීඩර්මල් සෛලවල ප්‍රති-β-ටියුබුලින් ප්‍රතිදේහ භාවිතා කරන ප්‍රතිශක්ති රසායන විද්‍යාව දිගු කලාපයේ එපීඩර්මල් සෛලවල සියලුම බාහික ක්ෂුද්ර නාල පාහේ අතුරුදහන් වී ඇති බව පෙන්නුම් කළේය (රූපය 6b).මෙම ප්‍රතිඵලවලින් පෙනී යන්නේ kumamotonic අම්ලය සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් ක්ෂුද්ර නාල වලට බාධා කිරීම සඳහා සෘජුව හෝ වක්‍රව ක්‍රියා කරන බවත් මෙම සංයෝග නව ක්ෂුද්ර නල නිෂේධක බවත්ය.
Ursonic අම්ලය සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් Arabidopsis thaliana හි cortical microtubules වෙනස් කරයි.(අ) දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන්හි විවිධ උර්මොටොනික් අම්ල ව්යුත්පන්නයන් හමුවේ මනිනු ලබන මූල ආනතිය කෝණය.ක්ෂුද්ර ටියුබල් වලක්වන සංයෝග දෙකක බලපෑම්: ඩිසොපිරමයිඩ් සහ ඔරිසාලින් ද විශ්ලේෂණය කරන ලදී.මූල වර්ධන කෝණය මැනීම සඳහා භාවිතා කරන සම්මතය ඇතුළත් කිරීම පෙන්වයි.තරු ලකුණු ව්යාජ ප්රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t test, p<0.05).n>19. පරිමාණ තීරුව = 1 සෙ.මී.(b) දිගු කලාපයේ එපීඩර්මල් සෛලවල බාහික ක්ෂුද්ර ටියුබල්.25 μM KAND 11 සහිත හෝ රහිතව MS තහඩු මත වගා කරන ලද වල්-වර්ගයේ Arabidopsis Col මුල්වල ඇති ක්ෂුද්ර නල β-tubulin ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ සහ Alexa Fluor-සංයුක්ත ද්විතීයික ප්‍රතිදේහ භාවිතයෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණ වර්ණ ගැන්වීම මගින් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.පරිමාණ තීරුව = 10 µm.(ඇ) මූල මෙරිස්ටම් හි ක්ෂුද්ර නාල වල මයිටොටික් ව්යුහය.ක්ෂුද්ර නාලිකා ප්‍රතිශක්තික රසායනික පැල්ලම් භාවිතයෙන් දෘශ්‍යමාන කරන ලදී.ප්‍රොපේස් කලාප, ස්පින්ඩල් සහ ෆ්‍රැග්මොප්ලාස්ට් ඇතුළු මයිටොටික් ව්‍යුහයන් කොන්ෆෝකල් රූපවලින් ගණනය කරන ලදී.ඊතල මගින් මයිටොටික් ක්ෂුද්ර නල ව්‍යුහයන් දක්වයි.තරු ලකුණු ව්යාජ ප්රතිකාර සමඟ සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (t test, p<0.05).n>9. පරිමාණ තීරුව = 50 µm.
උර්සාට ක්ෂුද්ර නාලිකා ක්‍රියාකාරිත්වය කඩාකප්පල් කිරීමේ හැකියාව ඇතත්, එහි ක්‍රියාකාරී යාන්ත්රණය සාමාන්‍ය ක්ෂුද්ර ටියුබියුල් ඩිපොලිමරයිසින් කාරකයන්ට වඩා වෙනස් වනු ඇතැයි අපේක්ෂා කෙරේ.උදාහරණයක් ලෙස, ඩිසොපිරමිඩ් සහ ඔරිසාලින් වැනි ක්ෂුද්ර ටියුබියුල් ඩිපොලිමරයිසින් කාරකවල ඉහළ සාන්ද්‍රණය එපීඩර්මල් සෛලවල ඇනිසොට්‍රොපික් ප්‍රසාරණය ඇති කරයි, නමුත් KAND 11 එසේ නොවේ.මීට අමතරව, KAND 11 සහ disopyramide සම-යෙදුම නිසා ඒකාබද්ධ disopyramide-induced root growth ප්රතිචාරයක් ඇති වූ අතර KAND 11-induced growth inhibition නිරීක්ෂණය කරන ලදී (Fig. S4).අපි KAND 11ට විකෘති වූ අධි සංවේදී ඩිසොපිරමයිඩ් 1-1 (phs1-1) හි ප්‍රතිචාරය ද විශ්ලේෂණය කළෙමු. phs1-1 හි කැනොනිකල් නොවන ටියුබියුලින් කයිනාස් ලක්ෂ්‍ය විකෘතියක් ඇති අතර ඩිසොපිරමිඩ්9,20 සමඟ ප්රතිකාර කළ විට කෙටි මූලයන් නිපදවයි.phs1-1 KAND 11 අඩංගු ආගාර් මාධ්‍යයේ වගා කරන ලද විකෘති බීජ පැලවල ඩිසොපිරමිඩ් මත වගා කරන ලද මුල් වලට සමාන කෙටි මුල් තිබුණි (fig. S5).
මීට අමතරව, KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද බීජ පැලවල මූල meristem හි prophase zones, Spindles සහ phragmoplasts වැනි මයිටොටික් ක්ෂුද්ර නාල ව්‍යුහයන් අපි නිරීක්ෂණය කළෙමු. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS සඳහා වන නිරීක්ෂණවලට අනුකූලව, සැලකිය යුතු අඩුවීමක් මයිටොටික් ක්ෂුද්ර නාල සංඛ්‍යාව නිරීක්ෂණය කරන ලදී (රූපය .6c).
උප සෛල විභේදනයේ දී KAND 11 හි සයිටොටොක්සිසිටි බව සංලක්ෂිත කිරීම සඳහා, අපි දුම්කොළ BY-2 අත්හිටුවීමේ සෛල KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කළ අතර ඒවායේ ප්‍රතිචාරය නිරීක්ෂණය කළෙමු.KAND 11 බාහිකයේ ක්ෂුද්ර නාල වල බලපෑම තක්සේරු කිරීම සඳහා ක්ෂුද්ර නල ප්‍රතිදීප්ත ලෙස ලේබල් කරන TagRFP-TUA6 ප්‍රකාශ කරන KAND 11 BY-2 සෛල වෙත අපි මුලින්ම එකතු කළෙමු.රූප විශ්ලේෂණය භාවිතයෙන් කෝටික ක්ෂුද්ර නාල ඝනත්වය තක්සේරු කරන ලද අතර එය සයිටොප්ලාස්මික් පික්සල අතර සයිටොස්කෙලෙටල් පික්සෙල් ප්‍රතිශතය ප්‍රමාණාත්මක විය.50 μM හෝ 100 μM KAND 11 සමඟ පැය 1 ක් ප්රතිකාර කිරීමෙන් පසු ඝනත්වය පිළිවෙළින් 0.94 ± 0.74% හෝ 0.23 ± 0.28% දක්වා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වූ අතර DMSO සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද සෛලවල ඝනත්වය 4.10 4 ක් වූ බව පරීක්ෂණ ප්‍රතිඵල පෙන්වා දුන්නේය. % (රූපය 7a).KAND 11 ප්‍රතිකාරය මගින් බාහික ක්ෂුද්ර ටියුබල්වල ඩිපොලිමරීකරණය ඇති කරන බව Arabidopsis හි නිරීක්ෂණයට මෙම ප්‍රතිඵල අනුකූල වේ (රූපය 6b).KAND 11 හි එකම සාන්ද්‍රණයකින් ප්රතිකාර කිරීමෙන් පසු GFP-ABD-ලේබල් කරන ලද ඇක්ටින් සූත්‍රිකා සමඟ අපි BY-2 රේඛාව පරීක්ෂා කළ අතර KAND 11 ප්‍රතිකාරය ඇක්ටින් සූතිකා වලට බාධා කරන බව නිරීක්ෂණය කළෙමු.පැය 1 ක් සඳහා 50 μM හෝ 100 μM KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කිරීම ඇක්ටින් සූත්‍රිකාවේ ඝනත්වය පිළිවෙළින් 1.20 ± 0.62% හෝ 0.61 ± 0.26% දක්වා සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කරන ලද අතර, DMSO-ප්රතිකාර කළ සෛලවල ඝනත්වය ± 1.69 විය.7b).මෙම ප්‍රතිඵල ඇක්ටින් සූතිකාවලට බලපාන්නේ නැති ප්‍රොපිසාමයිඩ් සහ ක්ෂුද්ර ටියුබුල්වලට බල නොපාන ඇක්ටින් ඩිපොලිමරයිසර් එකක් වන ලැට්‍රන්කුලින් බී (SI Figure S6) වල ප්‍රතිවිපාක සමඟ වෙනස් වේ.මීට අමතරව, coumamonamide 1, coumamonamide අම්ලය 6, හෝ KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කිරීම HeLa සෛලවල ඇති ක්ෂුද්ර නාල වලට බල නොපායි (SI Figure S7).මේ අනුව, KAND 11 හි ක්‍රියාකාරී යාන්ත්රණය දන්නා සයිටොස්කෙලිටන් කඩාකප්පල් කරන්නන්ගේ යාන්ත්‍රණයට වඩා වෙනස් යැයි විශ්වාස කෙරේ.මීට අමතරව, KAND 11 සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල පිළිබඳ අපගේ අන්වීක්ෂීය නිරීක්ෂණයෙන් KAND 11 ප්‍රතිකාරයේදී සෛල මිය යාමේ ආරම්භය අනාවරණය වූ අතර KAND 11 ප්‍රතිකාරයෙන් මිනිත්තු 30 කට පසුව Evans නිල් පැහැති මළ සෛලවල අනුපාතය සැලකිය යුතු ලෙස වැඩි නොවූ බව පෙන්නුම් කළේය. 50 μM හෝ 100 μM KAND සමඟ ප්රතිකාර කිරීමෙන් මිනිත්තු 90 කට පසුව, මියගිය සෛල සංඛ්‍යාව පිළිවෙලින් 43.7% හෝ 80.1% දක්වා වැඩි විය (රූපය 7c).එකට ගත් විට, මෙම දත්ත පෙන්නුම් කරන්නේ නව උර්සොලික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නය වන KAND 11 යනු කලින් නොදන්නා ක්‍රියාකාරී යාන්ත්‍රණයක් සහිත ශාක-විශේෂිත සයිටොස්කෙලිටල් නිෂේධනයක් බවයි.
KAND බාහිකයේ ක්ෂුද්ර නල, ඇක්ටින් සූතිකා සහ දුම්කොළ BY-2 සෛලවල ශක්‍යතාවට බලපායි.(a) TagRFP-TUA6 ඉදිරියේ BY-2 සෛල තුළ බාහික ක්ෂුද්ර ටියුබුල් දෘශ්‍යකරණය කිරීම.KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල confocal microscopy මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී.බාහිකයේ ක්ෂුද්ර නල ඝනත්වය ස්වාධීන සෛල 25 ක මයික්‍රොග්‍රැෆ් වලින් ගණනය කරන ලදී.අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (ටුකී එච්එස්ඩී පරීක්ෂණය, පි<0.05).පරිමාණ තීරුව = 10 µm.(b) GFP-ABD2 ඉදිරියේ දෘශ්‍යමාන වූ BY-2 සෛලවල කෝටිකල් ඇක්ටින් සූතිකා.KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල confocal microscopy මගින් පරීක්ෂා කරන ලදී.cortical Actin සූතිකාවල ඝනත්වය ස්වාධීන සෛල 25 ක මයික්රොග්රාෆ් වලින් ගණනය කරන ලදී.අකුරු සැලකිය යුතු වෙනස්කම් දක්වයි (ටුකී එච්එස්ඩී පරීක්ෂණය, පි<0.05).පරිමාණ තීරුව = 10 µm.(c) Evans blue staining මගින් මිය ගිය BY-2 සෛල නිරීක්ෂණය කිරීම.KAND 11 (50 μM හෝ 100 μM) හෝ DMSO සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද BY-2 සෛල දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර අන්වීක්ෂයකින් පරීක්ෂා කරන ලදී.n=3.පරිමාණ තීරුව = 100 µm.
නව ස්වභාවික නිෂ්පාදන සොයා ගැනීම සහ භාවිතය වෛද්‍ය විද්‍යාව සහ කෘෂිකර්මාන්තය ඇතුළු මිනිස් ජීවිතයේ විවිධ අංශවල සැලකිය යුතු දියුණුවක් ඇති කිරීමට හේතු වී තිබේ.ස්වභාවික සම්පත් වලින් ප්රයෝජනවත් සංයෝග ලබා ගැනීම සඳහා ඓතිහාසික පර්යේෂණ සිදු කර ඇත.විශේෂයෙන්, ඇක්ටිනොමයිසීටස්, පිළිකා නාශක කාරකයක් ලෙස ඖෂධීය වශයෙන් භාවිතා කරන, ivermectin සහ bleomycin හි ඊයම් සංයෝගය වන avermectin සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් වැනි විවිධ ද්විතියික පරිවෘත්තීය නිපදවීමට ඇති හැකියාව හේතුවෙන් නෙමටෝඩාවන් සඳහා ප්‍රති-පරපෝෂිත ප්‍රතිජීවක ලෙස ප්රයෝජනවත් වේ.ඒ හා සමානව, ඇක්ටිනොමිසයිට් වලින් විවිධ වල් නාශක සංයෝග සොයාගෙන ඇති අතර, ඒවායින් සමහරක් දැනටමත් වාණිජමය වශයෙන් 1,23 භාවිතා වේ.එබැවින්, අපේක්ෂිත ජීව විද්‍යාත්මක ක්‍රියාකාරකම් සහිත ස්වාභාවික නිෂ්පාදන හුදකලා කිරීම සඳහා ඇක්ටිනොමයිසීට් පරිවෘත්තීය විශ්ලේෂණය ඵලදායී උපාය මාර්ගයක් ලෙස සැලකේ.මෙම අධ්‍යයනයේදී, අපි S. werraensis වෙතින් coumamonamide නම් නව සංයෝගයක් සොයාගෙන එය සාර්ථකව සංස්ලේෂණය කළෙමු.Ursonic අම්ලය යනු urbenamide සහ එහි ව්‍යුත්පන්නවල කෘතිම අතරමැදියකි.එය ලාක්ෂණික මුල් රැලි ගැසීමට, මධ්‍යස්ථ සිට ප්‍රබල වල් නාශක ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රදර්ශනය කිරීමට සහ ශාක ක්ෂුද්ර නාල වලට සෘජුව හෝ වක්‍රව හානි කිරීමට හේතු විය හැක.කෙසේ වෙතත්, urmotonic අම්ලයේ ක්‍රියාකාරී යාන්ත්රණය දැනට පවතින ක්ෂුද්ර නල නිෂේධකවලට වඩා වෙනස් විය හැකිය, මන්ද KAND 11 ද ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කර සෛල මරණයට හේතු වන බැවින් urmotonic අම්ලය සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් පුළුල් පරාසයක සයිටොස්කෙලිටල් ව්‍යුහයන්ට බලපෑම් කරන නියාමන යාන්ත්‍රණයක් යෝජනා කරයි..
උර්බෙනොනික් අම්ලයේ තවදුරටත් සවිස්තරාත්මක ගුනාංගීකරනය urbenonic අම්ලයේ ක්රියාකාරිත්වයේ යාන්ත්රණය වඩා හොඳින් අවබෝධ කර ගැනීමට උපකාර වනු ඇත.විශේෂයෙන්ම, මීළඟ ඉලක්කය වන්නේ ursonic අම්ලය සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් ක්ෂුද්ර නාලිකා මත සෘජුවම ක්‍රියා කරන්නේද සහ ඒවා depolymerize කරන්නේද යන්න හෝ ඒවායේ ක්‍රියාව ක්ෂුද්ර නාල අස්ථාවර වීමට හේතු වේද යන්න තීරණය කිරීම සඳහා ඌර්සොනික් අම්ලය අඩු වූ ක්ෂුද්ර නාලිකාවලට බන්ධනය කිරීමට ඇති හැකියාව ඇගයීමයි.මීට අමතරව, ක්ෂුද්ර නල සෘජු ඉලක්කයක් නොවන අවස්ථාවක, ශාක සෛල මත ursonic අම්ලයේ ක්‍රියාකාරී ස්ථානය සහ අණුක ඉලක්ක හඳුනා ගැනීම අදාළ සංයෝගවල ගුණ සහ වල් නාශක ක්‍රියාකාරකම් වැඩි දියුණු කළ හැකි ක්‍රම තවදුරටත් අවබෝධ කර ගැනීමට උපකාරී වේ.E. coli හෝ HeLa සෛල වලට බලපෑමක් සිදු නොවූ අතර, Arabidopsis thaliana, දුම්කොළ සහ අක්මාව වැනි ශාකවල වර්ධනයට ursonic අම්ලයේ අද්විතීය සයිටොටොක්සික් හැකියාව අපගේ ජෛව ක්‍රියාකාරීත්ව විශ්ලේෂණය මගින් අනාවරණය විය.විවෘත කෘෂිකාර්මික ක්ෂේත්‍රවල භාවිතය සඳහා වල් නාශක ලෙස නිපදවා ඇත්නම්, සත්ව සෛල වලට සුළු හෝ විෂ සහිත වීම ඌර්සොනික් අම්ල ව්‍යුත්පන්නවල වාසියකි.ඇත්ත වශයෙන්ම, ක්ෂුද්ර නල යුකැරියෝට් වල පොදු ව්‍යුහයන් වන බැවින්, වල් නාශක සඳහා ප්‍රධාන අවශ්‍යතාවයක් වන්නේ ශාකවල ඒවායේ වරණාත්මක නිෂේධනයයි.උදාහරණයක් ලෙස, propyzamide, tubulin සමඟ සෘජුවම බන්ධනය වන සහ බහුඅවයවීකරණය වළක්වන microtubule depolymerizing නියෝජිතයා, සත්ව සෛල වලට එහි අඩු විෂ වීම නිසා වල් නාශකයක් ලෙස භාවිතා කරයි24.Disopyramide වලට ප්‍රතිවිරුද්ධව, ආශ්‍රිත බෙන්සාමයිඩ් වලට විවිධ ඉලක්ක විශේෂතා ඇත.ශාක ක්ෂුද්ර නාල වලට අමතරව, RH-4032 හෝ බෙන්සොක්සැමයිඩ් පිළිවෙළින් සත්ව සෛලවල ක්ෂුද්ර නාලිකා හෝ ඕමිසීටස් වලක්වන අතර, එහි අඩු phytotoxicity25,26,27 නිසා zalilamide දිලීර නාශකයක් ලෙස භාවිතා කරයි.අලුතින් සොයාගත් වලසා සහ එහි ව්යුත්පන්නයන් ශාකවලට එරෙහිව තෝරාගත් සයිටොටොක්සිසිටි බව ප්‍රදර්ශනය කරයි, නමුත් තවදුරටත් වෙනස් කිරීම් මගින් ඒවායේ ඉලක්ක විශේෂත්වය වෙනස් කළ හැකි බව සඳහන් කිරීම වටී, ව්යාධිජනක දිලීර හෝ ඕමිසීටීස් පාලනය සඳහා අතිරේක ව්යුත්පන්නයන් සැපයිය හැකිය.
උර්බෙනොනික් අම්ලය සහ එහි ව්‍යුත්පන්නවල අද්විතීය ගුණාංග වල් නාශක ලෙස සංවර්ධනය කිරීමට සහ පර්යේෂණ මෙවලම් ලෙස භාවිතා කිරීමට ප්රයෝජනවත් වේ.ශාක සෛල හැඩය පාලනය කිරීමේදී සයිටොස්කෙලිටනයේ වැදගත්කම පුළුල් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත.පූර්ව අධ්‍යයනයන් මගින් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ ශාක මෝර්ෆොජෙනසිස් නිසි ලෙස පාලනය කිරීම සඳහා ක්ෂුද්ර නල ගතිකත්වය පාලනය කිරීම මගින් බාහික ක්ෂුද්ර නල සංවිධානයේ සංකීර්ණ යාන්ත්‍රණයන් පරිණාමය කර ඇති බවයි.ක්ෂුද්ර නල ක්‍රියාකාරිත්වය නියාමනය කිරීම සඳහා වගකිව යුතු අණු විශාල ප්‍රමාණයක් හඳුනාගෙන ඇති අතර, ඊට අදාළ පර්යේෂණ තවමත් සිදුවෙමින් පවතී3,4,28.ශාක සෛලවල ක්ෂුද්ර නාලිකා ගතිකත්වය පිළිබඳ අපගේ වර්තමාන අවබෝධය cortical microtubule සංවිධානයේ යාන්ත්‍රණයන් සම්පූර්ණයෙන් පැහැදිලි නොකරයි.උදාහරණයක් ලෙස, disopyramide සහ oryzalin යන දෙකටම ක්ෂුද්ර ටියුබියුල්ස් depolymerize කළ හැකි වුවද, disopyramide මගින් දරුණු මූල විකෘතියක් ඇති කරන අතර oryzalin සාපේක්ෂව මෘදු බලපෑමක් ඇති කරයි.එපමනක් නොව, ක්ෂුද්ර නාලිකා ස්ථායීකරන ටියුබුලින් වල විකෘති කිරීම් ද මුල්වල ඩෙක්ස්ට්‍රොරොටේෂන් ඇති කරයි, නමුත් ක්ෂුද්ර නල ගතිකත්වය ස්ථායීකරණය කරන පැක්ලිටැක්සෙල් එසේ නොවේ.එබැවින්, උර්සොලික් අම්ලයේ අණුක ඉලක්ක අධ්යයනය කිරීම සහ හඳුනා ගැනීම ශාක බාහිකයේ ක්ෂුද්ර නාල නියාමනය පිළිබඳ නව අවබෝධයක් ලබා දිය යුතුය.එලෙසම, ඩිසොපිරමිඩ් වැනි විකෘති වර්ධනය ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා ඵලදායී වන රසායනික ද්රව්ය සහ ඔරිසාලින් හෝ කුමමෝටෝරික් අම්ලය වැනි අඩු ඵලදායී රසායනික ද්‍රව්‍යවල අනාගත සැසඳීම් මගින් විකෘති වර්ධනයක් සිදුවන ආකාරය පිළිබඳ ඉඟි සපයනු ඇත.
අනෙක් අතට, ආරක්‍ෂාව සම්බන්ධ සයිටොස්කෙලිටල් ප්‍රතිසංවිධානය උර්සොනික් අම්ලයේ සයිටොටොක්සිසිටි බව පැහැදිලි කිරීමට තවත් හැකියාවකි.රෝග කාරකයක් ආසාදනය වීම හෝ ශාක සෛල තුළට එලිසිටරයක් හඳුන්වා දීම සමහර විට සයිටොස්කෙලිටන් විනාශ වීමටත් පසුව සෛල මිය යාමටත් හේතු වේ.උදාහරණයක් ලෙස, Oomycete-ව්‍යුත්පන්න ක්‍රිප්ටොක්සැන්ටින් දුම්කොළ සෛල මිය යාමට පෙර ක්ෂුද්ර නාලිකා සහ ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කරන බවට වාර්තා වී ඇත, එය KAND ප්‍රතිකාරයේදී සිදු වන දෙයට සමාන වේ30,31.ursonic අම්ලය මගින් ප්‍රේරණය කරන ලද ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර සහ සෛලීය ප්‍රතිචාර අතර ඇති සමානකම්, Cryptoxanthin වලට වඩා ursonic අම්ලයේ වේගවත් හා ප්‍රබල බලපෑමක් පැහැදිලිව පෙනෙන්නට තිබුණද, ඒවා පොදු සෛලීය ක්‍රියාවලීන් අවුලුවන බවට උපකල්පනය කිරීමට අපට හේතු විය.කෙසේ වෙතත්, අධ්‍යයනයන් පෙන්වා දී ඇත්තේ ඇක්ටින් සූතිකා කඩාකප්පල් කිරීම ස්වයංසිද්ධ සෛල මරණයට ප්‍රවර්ධනය කරන අතර එය සෑම විටම ක්ෂුද්ර නල කඩාකප්පල් වීම සමඟ නොවේ.මීට අමතරව, උර්සොනික් අම්ල ව්යුත්පන්නයන් කරන පරිදි, රෝග කාරකය හෝ එලිසිටරය විකෘති මූල වර්ධනයට හේතු වේද යන්න සොයා බැලිය යුතුය.මේ අනුව, ආරක්ෂක ප්‍රතිචාර සහ සයිටොස්කෙලිටන් සම්බන්ධ කරන අණුක දැනුම ආමන්ත්‍රණය කළ යුතු ආකර්ශනීය ගැටලුවකි.උර්සොනික් අම්ලයට අදාළ අඩු අණුක බර සංයෝග මෙන්ම විවිධ ප්‍රබලතා සහිත ව්‍යුත්පන්න පරාසයක් තිබීම ප්‍රයෝජනයට ගැනීමෙන්, ඒවා නොදන්නා සෛලීය යාන්ත්‍රණයන් ඉලක්ක කර ගැනීමට අවස්ථාව ලබා දිය හැකිය.
එකට ගත් විට, ක්ෂුද්ර නල ගතිකත්වය මොඩියුලේට් කරන නව සංයෝග සොයා ගැනීම සහ යෙදීම ශාක සෛල හැඩය තීරණය කිරීමට යටින් පවතින සංකීර්ණ අණුක යාන්ත්‍රණයන් ආමන්ත්‍රණය කිරීමට ප්‍රබල ක්‍රම සපයනු ඇත.මෙම සන්දර්භය තුළ, ක්ෂුද්ර නල සහ ඇක්ටින් සූතිකා වලට බලපාන සහ සෛල මරණයට හේතු වන මෑතකදී දියුණු කරන ලද urmotonic අම්ලය සංයෝගය, ක්ෂුද්ර නල පාලනය සහ මෙම අනෙකුත් යාන්ත්‍රණ අතර සම්බන්ධය තේරුම් ගැනීමට අවස්ථාවක් ලබා දිය හැකිය.මේ අනුව, urbenonic අම්ලය භාවිතා කරන රසායනික හා ජීව විද්‍යාත්මක විශ්ලේෂණය ශාක සයිටොස්කෙලිටන් පාලනය කරන අණුක නියාමන යාන්ත්‍රණයන් තේරුම් ගැනීමට උපකාරී වේ.
S. werraensis MK493-CF1 2% (w/v) ග්ලැක්ටෝස්, 2% (w/v) එසෙන්ස් පේස්ට්, 1% (w/v) බැක්ටෝ සංයුතියෙන් සමන්විත බීජ මාධ්‍ය 110 mL අඩංගු 500 mL Baffled Erlenmeyer ප්ලාස්ක් එකකට එන්නත් කරන්න. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) ඉරිඟු සාරය (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 සහ 0.2% CaCO3 deionized ජලය තුළ.(වන්ධ්‍යාකරණයට පෙර pH අගය 7.4).බීජ සංස්කෘතීන් දින 2 ක් සඳහා 27 ° C දී භ්රමක ෂේකර් (180 rpm) මත ඉන්කියුටේෂන් කර ඇත.ඝන තත්වයේ පැසවීම හරහා නිෂ්පාදන වගාව.බීජ සංස්කෘතිය (මිලි ලීටර් 7) පීඩිත බාර්ලි ග්‍රෑම් 15 කින් (මූසෝ සමාගම, ලිමිටඩ්, ජපානය) සහ ඩියෝනීකරණය කළ ජලය ග්‍රෑම් 25 කින් සමන්විත නිෂ්පාදන මාධ්‍ය ග්‍රෑම් 40 ක් අඩංගු 500 ml K-1 නළයකට මාරු කරන ලදී (pH අගය සකස් කර නැත. විෂබීජහරණයට පෙර).)පැසවීම දින 14 ක් අඳුරේ 30 ° C දී සිදු කරන ලදී.පැසවීම ද්රව්ය 40 ml / බෝතලය EtOH සහ කේන්ද්රාපසාරී (1500 g, 4 ° C, 10 min) සමඟ නිස්සාරණය කර ඇත.10% MeOH/EtOAc මිශ්‍රණයකින් සංස්කෘත අධිප්‍රමාණය (60 ml) නිස්සාරණය කර ඇත.කාබනික ස්තරය අවශේෂයක් (59.5 mg) ලබා ගැනීම සඳහා අඩු පීඩනයක් යටතේ වාෂ්ප වී ඇති අතර, එය ප්‍රතිලෝම අදියර තීරුවක (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID) අනුක්‍රමය ඉවත් කිරීම (මිනිත්තු 0-10: 90%) සමඟ HPLC වලට යටත් විය. 10 mm × දිග 250 mm) H2O/CH3CN, විනාඩි 10-35: 90% H2O/CH3CN සිට 70% H2O/CH3CN (gradient), 35-45 විනාඩි: 90% H2O/EtOH, 45-155 විනාඩි: 90% H2O / EtOH සිට 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) 1.5 ml / min ප්රවාහ අනුපාතයකින්, coumamonamide (1, 36.0 mg) සුදු අස්ඵටික කුඩු ලෙස හුදකලා විය.
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ගණනය කළ අගය: 141.0659, මනින ලද අගය: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 15973, 15973 සෙ.මී.
කොලොම්බියා බීජ (Col-0) පර්යේෂණ භාවිතය සඳහා අවසරය ඇතිව Arabidopsis ජීව විද්‍යාත්මක සම්පත් මධ්‍යස්ථානයෙන් (ABRC) ලබා ගන්නා ලදී.Col-0 බීජ අපගේ රසායනාගාර තත්වයන් යටතේ ප්‍රචාරණය කර නඩත්තු කරන ලද අතර වල්-වර්ගයේ Arabidopsis ශාක ලෙස භාවිතා කරන ලදී.2% සුක්‍රෝස් (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) ethanesulfonic අම්ලය (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) අඩංගු අර්ධ-ශක්ති මුරාෂිගේ සහ ස්කූග් මාධ්‍යයෙන් Arabidopsis බීජ මතුපිට විෂබීජහරණය කර වගා කරන ලදී. )) සහ 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, 23 °C සහ නියත ආලෝකය.phs1-1 විකෘතියේ බීජ T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) විසින් සපයන ලදී.
SR-1 වික්‍රියා බීජ T. Hashimoto (නාරා විද්‍යා හා තාක්ෂණ ආයතනය) විසින් සපයන ලද අතර වල්-වර්ගයේ දුම්කොළ පැල ලෙස භාවිතා කරන ලදී.දුම්කොළ බීජ මතුපිට විෂබීජහරණය කර ප්රරෝහණය ප්‍රවර්ධනය කිරීම සඳහා වඳ ජලයේ රාත්‍රී තුනක් පොඟවා, පසුව 2% සුක්‍රෝස්, 0.05% (w/v) MES සහ 0.8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) අඩංගු අර්ධ ශක්තිමත් ද්‍රාවණයක තැන්පත් කරන ලදී. මුරෂිගේ.සහ ස්කූග් මාධ්‍යය) pH 5.7 සහිත සහ නියත ආලෝකය යටතේ 23 ° C දී පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කර ඇත.
Strain Tak-1 සපයන ලද්දේ T. Kohchi (Kyoto University) විසින් වන අතර Liverwort අධ්යයනය සඳහා සම්මත පර්යේෂණාත්මක ඒකකය ලෙස භාවිතා කරන ලදී.ජීවානුහරණය කරන ලද වගා කරන ලද ශාක වලින් මැණික් ලබාගෙන පසුව 1% සුක්‍රෝස් සහ 0.3% ජෙලන් ගම් අඩංගු Gamborg B5 මාධ්‍යයේ (Fujifilm Wako Pure Chemical) ආලේප කර අඛණ්ඩ ආලෝකය යටතේ 23 ° C දී පුර්වකාශනය කරන ලදී.
දුම්කොළ BY-2 සෛල (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (ටෝකියෝ විශ්ව විද්‍යාලය) විසින් සපයන ලදී.BY-2 සෛල නවීකරණය කරන ලද Linsmeier සහ Skoog මාධ්‍යයේ 95 ගුණයකින් තනුක කර සතිපතා 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32 සමඟ පරිපූරණය කරන ලදී.සෛල අත්හිටුවීම අඳුරේ දී 27 ° C දී 130 rpm දී භ්රමක ෂේකර් මත මිශ්ර කර ඇත.නැවුම් මාධ්‍යයේ පරිමාව මෙන් 10 ගුණයකින් සෛල සෝදන්න සහ එම මාධ්‍යයේම නැවත සවි කරන්න.BY-2 සංක්‍රාන්ති සෛල රේඛා ස්ථායීව ප්‍රකාශ කරන ක්ෂුද්ර නල මාර්කර් TagRFP-TUA6 හෝ වට්ටක්කා මොසෙයික් වයිරස් 35S ප්‍රවර්ධකය යටතේ ඇති ඇක්ටින් සූත්‍රිකා සලකුණු GFP-ABD2 විස්තර කර ඇති පරිදි 33,34,35 ජනනය කර ඇත.මෙම සෛල රේඛා මුල් BY-2 සෛල රේඛාව සඳහා භාවිතා කරන ලද ක්‍රියා පටිපාටි භාවිතා කරමින් පවත්වා ගෙන යා හැකි අතර සමමුහුර්ත කළ හැක.
HeLa සෛල Dulbecco හි නවීකරණය කරන ලද ඊගල් මාධ්‍යයේ (DMEM) (Life Technologies) 10% භ්‍රෑණ ගව මස්තු, 1.2 U/ml පෙනිසිලින් සහ 1.2 μg/ml ස්ට්‍රෙප්ටොමයිසින් සමඟ 37°C incubator එකක 37°C.
මෙම අත්පිටපතේ විස්තර කර ඇති සියලුම අත්හදා බැලීම් ජපන් ජෛව ආරක්ෂණ රෙගුලාසි සහ මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සිදු කරන ලදී.
සංයෝග කොටස් ද්‍රාවණ ලෙස ඩයිමෙතිල් සල්ෆොක්සයිඩ් (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ද්‍රාවණය කර Arabidopsis සහ දුම්කොළ සඳහා MS මාධ්‍යයේ තනුක කර හෝ අක්මාව සඳහා Gamborg B5 මාධ්‍යය.මූල වර්ධන නිෂේධන තක්සේරුව සඳහා, එක් පිඟානකට බීජ 10 කට වඩා වැඩි ප්‍රමාණයක් දක්වා ඇති සංයෝග හෝ DMSO අඩංගු ආගාර් මාධ්‍යයේ වපුරා ඇත.බීජ දින 7 ක් වර්ධන කුටියක තැන්පත් කර ඇත.බීජ පැල ඡායාරූප ගත කර ඇති අතර මුල්වල දිග මනිනු ලැබේ.Arabidopsis ප්‍රරෝහණ විශ්ලේෂණය සඳහා, 200 μM සංයෝගයක් හෝ DMSO අඩංගු agar මාධ්‍යයක් මත පිඟානකට බීජ 48ක් වපුරා ඇත.Arabidopsis බීජ වර්ධන කුටියක වගා කර ඇති අතර ප්රරෝහණය වී දින 7 කට පසු (dag) ප්රරෝහණය වූ බීජ පැල ගණන ගණනය කරන ලදී.දුම්කොළ ප්‍රරෝහණ තක්සේරුව සඳහා, 200 μM KAND හෝ DMSO අඩංගු agar මාධ්‍යයක් මත පිඟානකට බීජ 24ක් වපුරා ඇත.දුම්කොළ බීජ වර්ධන කුටියක වගා කරන ලද අතර දින 14 කට පසු ප්රරෝහණය වූ බීජ පැල ගණන ගණනය කරන ලදී.ලිවර්වර්ට් වර්ධක නිෂේධන තක්සේරුව සඳහා, එක් එක් තහඩුවකින් කළල 9ක් KAND හෝ DMSO හි දක්වා ඇති සාන්ද්‍රණයන් අඩංගු agar මාධ්‍යයේ ආලේප කර දින 14ක් වර්ධන කුටියක පුර්ව තැන්පත් කරන ලදී.
මූල මෙරිස්ටම් සංවිධානය දෘශ්‍යමාන කිරීම සඳහා 5 mg/ml propidium අයඩයිඩ් (PI) සහිත පැල්ලම් සහිත බීජ පැල භාවිතා කරන්න.PI සංඥා TCS SPE confocal ලේසර් ස්කෑනිං අන්වීක්ෂයක් (Leica Microsystems) භාවිතයෙන් ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂය මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
Malami සහ Benfey36 විසින් විස්තර කරන ලද ප්‍රොටෝකෝලය අනුව β-glucuronidase (GUS) සමඟ මුල්වල histochemical staining සිදු කරන ලදී.බීජ පැල 90% ඇසිටෝන් එක රැයකින් සවි කර, 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic අම්ලය සමඟ GUS බෆරයේ පැය 1 ක් පැල්ලම් කර හයිඩ්‍රේටඩ් ක්ලෝරල්ඩිහයිඩ් ද්‍රාවණයක තබා ඇත.(8 g chloral hydrate, 2 ml ජලය සහ 1 ml glycerol) සහ Axio Imager M1 අන්වීක්ෂයක් (Carl Zeiss) භාවිතා කරමින් අවකල්‍ය මැදිහත්වීම් ප්‍රතිවිරුද්ධ අන්වීක්ෂයක් මගින් නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
සිරස් අතට තැබූ තහඩු මත වගා කරන ලද දින 7 ක් පැරණි බීජ පැල මත මුල් කෝණ මනිනු ලැබේ.පියවර 6 හි විස්තර කර ඇති පරිදි ගුරුත්වාකර්ෂණ දෛශිකයේ දිශාවේ සිට මූලයේ කෝණය මැනීම.
ප්‍රොටෝකෝලය 37 හි සුළු වෙනස් කිරීම් සමඟ විස්තර කර ඇති පරිදි බාහිකයේ ක්ෂුද්ර නාල වල සැකැස්ම නිරීක්ෂණය කරන ලදී.Anti-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) සහ Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ප්‍රාථමික සහ ද්විතියික ප්‍රතිදේහ ලෙස 1:1000 සහ 1:100 තනුක ලෙස භාවිතා කරන ලදී. පිළිවෙලින්.TCS SPE confocal ලේසර් ස්කෑනිං අන්වීක්ෂයක් (Leica Microsystems) භාවිතයෙන් ප්‍රතිදීප්ත රූප ලබා ගන්නා ලදී.Z-stack පින්තූර ලබාගෙන නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව උපරිම තීව්‍රතා ප්‍රක්ෂේපන සාදන්න.
නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව සෛල ගණන් කිරීමේ කට්ටලය 8 (ඩොජින්ඩෝ) භාවිතයෙන් HeLa සෛල ප්‍රගුණනය විශ්ලේෂණය සිදු කරන ලදී.
E. coli DH5α හි වර්ධනය 600 nm (OD600) දී වර්ණාවලීක්ෂ ඡායා රූපමානයක් භාවිතයෙන් සංස්කෘතියේ සෛල ඝනත්වය මැනීම මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී.
CSU-X1 confocal ස්කෑනිං උපාංගයක් (Yokogawa) සහ sCMOS කැමරාවක් (Zyla, Andor Technology) සහිත ප්‍රතිදීප්ත අන්වීක්ෂයක් භාවිතයෙන් සංක්‍රාන්ති BY-2 සෛලවල සෛල අස්ථි සංවිධානය නිරීක්ෂණය කරන ලදී.38,39 විස්තර කර ඇති පරිදි ImageJ මෘදුකාංගය භාවිතා කරමින් confocal රූපවල ඇති සයිටොප්ලාස්මික් පික්සල අතර සයිටොස්කෙලෙටල් පික්සෙල් ප්‍රතිශතය ප්‍රමාණනය කරන ලද රූප විශ්ලේෂණය මගින් සයිටොස්කෙලිටල් ඝනත්වය තක්සේරු කරන ලදී.
BY-2 සෛල තුළ සෛල මිය යාම හඳුනා ගැනීම සඳහා, සෛල අත්හිටුවීමේ ඇල්කෝට් එකක් කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 10 ක් සඳහා 0.05% Evans blue සමඟ පුර්වගත කරන ලදී.මිය ගිය සෛලවල වරණීය එවන්ස් නිල් පැහැය රඳා පවතින්නේ නොවෙනස්ව පවතින ප්ලාස්මා පටලය මගින් ශක්‍ය සෛල වලින් සායම් නිස්සාරණය කිරීම මත ය.දීප්තිමත් ක්ෂේත්‍ර අන්වීක්ෂයක් (BX53, Olympus) භාවිතයෙන් පැල්ලම් සහිත සෛල නිරීක්ෂණය කරන ලදී.
HeLa සෛල 37 ° C සහ 5% CO2 හි ආර්ද්‍රතා සහිත ඉන්කියුබේටරයක 10% FBS සමඟ අතිරේක DMEM හි වර්ධනය විය.සෛල 100 μM KAND 11, kumamonamic අම්ලය 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), හෝ 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) සමඟ 37 ° C දී පැය 6 ක් සඳහා ප්රතිකාර කරන ලදී.සෛල MetOH සමඟ මිනිත්තු 10 ක් සහ පසුව ඇසිටේට් සමඟ කාමර උෂ්ණත්වයේ දී විනාඩි 5 ක් සවි කර ඇත.ස්ථාවර සෛල β-tubulin ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ (1D4A4, Proteintech: 66240-1) සමඟ 0.5% BSA/PBS තනුක කර පැය 2ක් තනුක කර, TBST සමඟ 3 වරක් සෝදා, පසුව Alexa Fluor එළු ප්‍රතිදේහයෙන් පුර්වගත කරන ලදී.488 පැය 1.– Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) සහ 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.5% BSA/PBS තනුක කර ඇත.TBST සමඟ තුන් වරක් සේදීමෙන් පසු, Nikon Eclipse Ti-E ප්‍රතිලෝම අන්වීක්ෂයක පැල්ලම් සහිත සෛල නිරීක්ෂණය කරන ලදී.MetaMorph මෘදුකාංග (අණුක උපාංග) භාවිතයෙන් සිසිල් කරන ලද Hamamatsu ORCA-R2 CCD කැමරාවකින් පින්තූර ලබා ගන්නා ලදී.
පසු කාලය: ජූනි-17-2024